通关藤致U937 细胞凋亡效应与机制.doc

文档介绍：通关藤致U937 细胞凋亡效应与机制
摘要:目的: 研究通关藤对U937细胞凋亡效应与调控及周期改变。方法:应用噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度通关藤对U937细胞的增殖抑制作用,以Annexin-Ⅴ/PI双染法检测细胞凋亡,以RT-PCR法检测bax、bcl-2、p53的基因表达水平的改变。结果:10、20、40、80μL/ mL通关藤对U937细胞染毒24h后,%、%、%、%,10、20、40、80μL/ mL %、%、%、%,10、20、40μL/ mL 通关藤对U937细胞染毒24h后bax/bcl-、、,、、。结论: 通关藤能抑制U937细胞生长,诱导细胞发生凋亡,且具有剂量反应关系,其凋亡的机制可能与Bax/Bcl-2的上升,及p53的mRNA表达的上调有关。
关键词:通关藤;U937细胞;细胞毒性;Bax/Bcl-2;P53
近年来,传统中药通关藤在实体瘤的临床治疗中取得了较好的疗效[1-3]。但通关藤注射液在血液肿瘤治疗中应用较少。有研究表明,低浓度的通关藤可诱导白血病 NB4 细胞分化, 高浓度可通过线粒体途径诱导白血病细胞U937, HL60凋亡[4-5] 。为进一步探讨通关藤抗白血病的作用及相关凋亡的可能机制, 本文用体外对U937细胞进行不同浓度的通关藤染毒,观察对U937细胞的抑制作用,对细胞凋亡、细胞周期的影响并检测相关基因的表达。
1 材料与方法
材料
细胞株:
U937 细胞购自中科院上海细胞库。
主要试剂及仪器:
通关藤注射液( 消癌平注射液, 20 mL/ 支, 批号:20070405111)、凯基活细胞/凋亡细胞/坏死细胞鉴别试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司);Mithras LB941多功能酶标仪(德国Berthold technologics),PCR仪(Eppendorf-AG),凝胶成像处理系统(ChemilmagerTM 5500 Alpha innotech),ABI 7300型荧光定量PCR仪(美国应用生物系统中国公司)。
方法
通关藤对U937细胞的增值抑制作用
以含10%胎牛血清的RPMI1640培养基正常培养细胞。实验时取对数生长期细胞以1×104个/孔接种于96孔培养板中培养24 h,用含通关藤终浓度为, 10、20、40、80μL/ mL的培养基100μl染毒24 h,每个剂量设3个平行。染毒结束后吸取培养基,加入含10% MTT的无血清培养基100μl作用4 h,再吸取培养基,加入150 ?l DMSO溶解蓝紫色结晶物,每孔平行吸取三次各150 ?l到96孔板在酶标仪上选择490 nm波长测定各孔吸光度值(A)。按公式计算各组细胞相对增值率, 细胞相对增值率(%) = (各染毒组A值-空白组A值) ×100% /(阴性对照A值-空白组A值)。
通关藤对U937细胞凋亡作用
取对数生长期细胞以2×105 个/孔接种于六孔培养板中培养24 h。剂量效应研究:用含通关终浓