文档介绍：实验一植物基因组DNA的提取一、实验目的掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学****根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。二、实验原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞,由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨,材料易于破碎,并减少研磨过程中各种酶类的作用。十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三***溴化铵(hexadyltrimethylammomumbromide,简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate,简称SDS)等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和***仿等有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸(DNA、RNA)水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE溶液中,即得植物总DNA溶液。三、实验材料水稻幼叶四、主要试剂配方2%CTAB抽提缓冲溶液:-HCl20ml(),先用70mlddH2O溶解,再定容至200ml灭菌,-1%2-巯基乙醇(400ul)***仿-异戊醇(24:1):先加96ml***仿,再加4ml异戊醇,摇匀即可。五、(1)2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。(2)取少量叶片(约1g)置于研钵中,用液氮磨至粉状;(3)加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液,轻轻搅动;(4),磨碎液的高度约占管的三分之二;(5)置于65℃的水浴槽或恒温箱中,每隔10min轻轻摇动,40min后取出;(6)冷却2min后,加入***仿-异戊醇(24:1)至满管,剧烈振荡2~3min,使两者混合均匀;(7)放入离心机中10000rpm离心10min,与此同时,将600µl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中;(8)10000rpm离心1min后,移液器轻轻地吸取上清夜,转入含有异丙醇的离心管内,将离心管慢慢上下摇动30sec,使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物;(9)10000rpm离心1min后,立即倒掉液体,注意勿将白色DNA沉淀倒出,将离心管倒立于铺开的纸巾上;(10)60sec后,直立离心管,加入720µl的75%乙醇及80µl5M的醋酸钠,轻轻转动,用手指弹管尖,使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中;(11)放置30min,使DNA块状物的不纯物溶解;(12)10000rpm离心1min后,倒掉液体,再加入800µl75%的乙醇,将DNA再洗30min;(13)10000rpm离心30sec后,立即倒掉液体,将离心管倒立于铺开的纸巾上;数分钟后,直立离心管,干燥DNA(自然风干或用风筒吹干);(14)加入50µ×TE(含RNase)缓冲液,使DNA溶解,置于37℃恒温箱约15h,使RNA消解;(15)置于-20℃保存、备用。,原理和方法见实验二。六、注意事项(1)叶片磨得越细越好。(2)移液器的使用。(3)由于植物细胞中含有大量的DNA酶,因此,除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外,第一步的操作应迅速,以免组织解冻,导致细胞裂解,释放出DNA酶,使DNA降解。思考题:?CTAB,***仿,异丙醇,75%乙醇,?各有何优缺点?实验二多聚酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)基因扩增及琼脂糖凝胶电泳检测一、实验目的通过本实验学****PCR反应的基本原理,掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。二、实验原理PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段,即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下:PCR循环过程中有三种不同的事件发生:(1)模板变性;(2)引物退火;(3)热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。:加热使模板DNA在高温下(94-95℃)变性,双链间的氢键断裂而形成两条单链,即变性阶段。:在体系温度降至37-65℃,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合,使引物与模板链3’端结合,形成部分双链DNA,即退火阶段。:体系反应温度升至中温72℃,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物的引导下,利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP),按5’到3’方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段。上述3步为一个循环,即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上