文档介绍：分子克隆(一)基本概念:克隆(Clone)指的是通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。分子克隆(MolecularCloning)是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组,将重组分子导入到合适的受体细胞中,使其在细胞中扩增和繁殖,以获得DNA分子大量复制,并使受体细胞获得新得遗传特征的过程。载体DNA(vector)目的DNA(targetfragment)重组DNA(binantDNA)宿主(host)筛选、扩增克隆(clone)分子克隆的路线DNA重组转化分子克隆的基本过程分—获取目的基因和载体接—目的基因与载体的连接筛—重组DNA的筛选与鉴定转—重组DNA导入宿主细胞目的基因的获取-----PCR技术:定义:PCR技术又称聚合酶链式反应(polymerasechainreaction),是通过模拟体内DNA复制的方式,在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。Heat-stablepolymeraseisvitaltotheeaseoftheprocess…thermusaquaticusTaqDNA多聚酶的发现1988年Saiki等从温泉( Hot spring)中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点:①耐高温,②在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率,增加了扩增长度()。酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNA Polymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。在 1989 年,Science 将PCR中的TaqDNA多聚酶命名为当年的风云分子 (Molecule of the year)①94℃变性②50-65℃退火③72℃:20-40个PCR循环1个PCR循环PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火①模板:单链或双链DNA②引物:16-30bp合成的寡核苷酸③DNA聚合酶:耐热的DNA聚合酶④底物:四种脱氧三磷酸核苷(dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)⑤Mg2+: