文档介绍：MTT法目的和意义检测细胞存活和生长情况用于评价药物产生的细胞毒作用原理四唑盐(噻唑蓝)是一种能接受氢原子的染料,简称MTT活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二***亚砜(DMSO)能溶解细胞中的紫蓝色结晶物,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量,从而反映细胞的增殖情况。在一定细胞数范围内,MTT结晶物形成的量与活细胞数成正比。活细胞+MTT琥珀酸脱氢酶紫蓝色结晶物Formazan贴壁细胞操作步骤1.  接种细胞:%胰蛋白酶消化单层培养细胞,用含血清的培养液配成单个细胞悬液,以每孔2000-3000个细胞接种于96孔培养板中,每孔体积90ul。(边缘孔用PBS或空白培养基填充)。 2.  培养细胞:将培养板移入CO2孵箱中,在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板,大约12h),加入浓度梯度的药物。原则上,细胞贴壁后即可加药,每孔加药10ul,一般设5个复孔。%CO2,37℃孵育分别孵育24小时后,倒置显微镜下观察。悬浮细胞操作步骤:1)将细胞离心收集后,调节细胞悬液浓度大约1×104/ml,每孔先加细胞悬液90ul,相应梯度的药物每孔10ul;共100ul加入到96孔板(边缘孔用PBS填充)。每板设对照。同时设置调零孔(培养基、MTT、二***亚砜),对照孔(细胞、培养液、MTT、二***亚砜),每组设5个复孔。2)置37℃,5%CO2孵育24小时,倒置显微镜下观察。3)每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml,%MTT),继续培养4h4)每孔加三联裂解液(10gSDS,异丁醇5ml,)过夜,第二天早晨置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm测量各孔的吸光值。药物的配制浓度体积过滤MTT的配制MTT一般最好现用现配,过滤后4ºC避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性,用的时候小心,,MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系,因为时间较短。实验结果统计学处理所有数值以x±s表示,应用SPSS软件进行方差分析,p<,p<。可以以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制细胞生线曲线,专门公式求IC50(半数抑制浓度)。或计算抑制率。OD对照组-OD实验组抑制率%=OD对照组×100%实验结果统计学处理公式如下:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) Xm:lg最大剂量 I:lg(最大剂量/相临剂量) P:阳性反应率之和 Pm:最大阳性反应率 Pn:最小阳性反应率