文档介绍：:1、掌握质粒DNA分离,纯化的原理2、学****煮沸法快速提取质粒DNA的方法3、学****DNA的限制性酶切的基本技术4、学****利用琼脂糖电泳测定DN***段的长度二、实验原理在基因工程中,DNA分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的DNA序列,在一定的条件下切断双链DNA。限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的,如反应温度,缓冲体系,离子种类与浓度,DNA的纯度和***化程度等。对DNA进行酶切时,首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切,应选用该酶的最适缓冲液;对于双酶切或三酶切,应选用一种能使所有酶都充分作用的缓冲液。DNA的纯度对于酶切的效果的影响也很大,因为蛋白质。酚。***仿。SDS等杂质都会抑制限制性内切酶的活性。琼脂糖凝胶电泳是分离,鉴定和纯化DN***段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料-溴化乙锭进行染色,可确定DNA在凝胶中的位置。如有必要,还可以从凝胶中回收DNA条带,用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰***凝胶低,但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kbp的DNA。长度100kb或更大的DNA,可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。在基因工程的常规操作中,琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置,在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA分子在凝胶缓冲液(一般为碱性)中带负电荷,在电场中由负极向正极迁移。DNA分子迁移的速率受分子大小,构象。电场强度和方向,碱基组成,温度和嵌入染料等因素的影响。::含pUC18的大肠杆菌JM107菌株。(1)LB培养基:NaCl10g/l酵母提取物5g/l胰蛋白胨10g/l氨苄青霉素50μg/ml(培养基灭菌后加入)(2)70%乙醇(-20℃)及无水乙醇(-20℃)(3)STET缓冲液()(8%蔗糖,%Triton,50mmol/LEDTA,,10mmol/LTris)(4)5%CTAB(十六烷基三***溴化氨)(5)***化钠(6)TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA)(7)电泳缓冲液(50XTAE)Tris242g,,EDTA()100ml使用时用蒸馏水稀释50倍。(8)样品缓冲液(6X)%溴酚蓝,%二甲苯青,40%(W/V)蔗糖(9)溴化乙锭10mg/ml(10)琼脂糖(电泳级)(11)限制性内切酶(12)溶菌酶(50mg/ml,溶于10mmol/LTris-HCl,):台式离心机、超净工作台、高压灭菌锅、恒温振荡培养箱、恒温水浴箱等。Eppendorf离心管,Tip头,三角瓶等灭菌备用。电泳仪,电泳槽,样品梳,微波炉,水浴锅,移液器(20ul,200ul和1000ul),离心管,Tips(200ul,1000ul)。:(1)将2ml含相应抗生素的LB培养基加入到容量为15ml的试管中,接种一单菌落,用棉塞封口,在37℃剧烈震荡(250rpm)培养过夜。(2),用台式离心机在4℃条件下离心30秒(12,000×g)。(3)