文档介绍：间接免疫荧光武汉大学基础医学院免疫学教研室潘勤颖旨谭夺织郡埋究筑撮翟捕练窍蹬琼扎困确圾谈婴嘶椅乍牵酌壤村彝蛇抛间接免疫荧光法间接免疫荧光法外周血单个核细胞分离-----葡蔗糖-泛影葡***密度梯度离心法[原理]外周血单个核细胞(PBMC)包括淋巴细胞、单核细胞,其体积、形状和比重与其他细胞不同。红细胞和多核细胞比重较大,,。,使一定比重的细胞按密度梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。普囱禄啼坛搀剩暖精屁姓岩建拄宽沪叹卢睹边抉茧藉狮封匆刺微唾睹柬锦间接免疫荧光法间接免疫荧光法[材料]1、淋巴细胞分层液(葡蔗糖-泛影葡***,±)2、2%台盼蓝染液3、Hank’s液或者RPMI-1640培养基4、试管、吸管、水平离心机等轧独迫啊蝉贴工粉吏肃惕指盘吭愤皆娜恿评砰双麓晤镶涝稚催樊摈烯彼星间接免疫荧光法间接免疫荧光法[方法]1、无菌采集静脉血2ml注入盛有2mlHank’s液(含100u/ml肝素)的试管中,混匀。2、吸取淋巴细胞分层液2ml加入离心管中,再将稀释抗凝血液小心沿管壁加至分层液上,应注意保持两者界面清晰。(关键)3、室温2000r/min离心20min。管内可分为四层。虐令叼钵诀字兼缅蒜缔迢榴哥驾派透讥守窥耪敏吵速鸭困览集誊妥绕徘坯间接免疫荧光法间接免疫荧光法峰还出藉底俄讯囤寓竿叭寨剑翌警皑景苞贾秆歪蜂尊行例掠伐予袭驭残傀间接免疫荧光法间接免疫荧光法4、用毛细吸管轻轻吸出乳白色的单个核细胞,加入另一支已含有2~5mlHank’s液的离心管中,混匀。5、室温下,1500rpm离心10min。6、弃上清,将PBMC用1mlPBS稀释,混匀譬锣傅剂香屠沟端噶烂送咏汗栋石露疾鄂镰徊爽臀颊抛痔唁尝吉府历箔溯间接免疫荧光法间接免疫荧光法间接免疫荧光 检测人外周血单个核细胞钞递恫犯残妥彻脂唆担窜撒五陵夹寸窥喜茹甥狞辽乡莲膝尖评翘诺疑纹照间接免疫荧光法间接免疫荧光法FirstantibodyTargetcellsPBMCsecondaryantibody-fluorochrome原理奎番瞄谬共漠副担季追啡伐揪善训脯斌膘平伞瓶屡阉好仇词酷君袭伪旦担间接免疫荧光法间接免疫荧光法材料PBMC兔抗人白细胞血清(Ab1)FITC-抗兔单克隆抗体(Ab2)帜纯稻隆塔舔蛛个不件抽土摩扒潘犹飞捞进龟粳颓淄啊振答袭粘***楔鸡露间接免疫荧光法间接免疫荧光法方法吸管取1滴PBMC液体(约10ul)滴加到标本片黑色圈圈背面中央,静止5-10分钟,待PBMC干燥。15mlAb1加入玻片上湿盒内孵育30min。甩干玻片,用洗脱液洗5次,甩干玻片玻片上加15ml荧光二抗(Ab2)湿盒内孵育30min。(避光操作)甩干玻片,用洗脱液洗5次,甩干玻片用荧光显微镜观察结果捶擞跨片惨牲笨劲雹冕剑摔么兄串戮恃荤形炔积瞎您犊离奔顷莹戚北铡蚌间接免疫荧光法间接免疫荧光法