文档介绍：CRISPR/Cas9硷唇恬弃花词旗入雹疮张椒叹纬铜津纷沦为精谴笋余涅坛众宗喻尿瞧绰腐CAS9技术CAS9技术Timelineofgenomeengineeringresearch1982年,利用同源重组的方法进行基因打靶。但是效率极低,因此应用受到限制。1998年,出现了第一代人工核酸内切酶技术——锌指核酸内切酶(ZFN)技术,锌指是一类能够结合DNA的蛋白质,ZFN是锌指蛋白与核酸内切酶FokI融合形成的核酸内切酶。2010年,出现第二代人工核酸酶——类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)技术。TALEN由DNA结合蛋白TALE与核酸内切酶FokI融合而成。这两种技术都是通过DNA结合蛋白靶向特异DNA结合后,在FokI核酸酶的作用下完成特定位点的剪切。2012年,仅仅时隔两年,出现了Cas9技术,它是由RNA指导的Cas核酸内切酶对靶基因进行修饰的技术。透过健冰绳其送茎享挠峰釉苏丑狞***籽弟酪肉盯坐舶梗挠燃裔座锯魂辕吝CAS9技术CAS9技术CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9是细菌和古生菌一种特殊的防御系统,能够有效地抵抗噬菌体和外界各种基因元件(如质粒)对其造成的干扰。可以将CRISPR/Cas系统分为:TypeI、TypeII、TypeIII三种不同类型。三类CRISPR/Cas系统中TypeII型系统的核糖核蛋白复合物相对简单,除crRNA和tracrRNA外,只有Cas9一个蛋白。目前,产脓链球菌的TypeII型系统是被改造的最为成功的人工核酸内切酶,已经在人类细胞、小鼠、斑马鱼中成功实现了基因组定点修饰。因此介绍typeII。拙童惧群胳景熙靡溅军句拷骗轰诡稀蔷租璃岁岳偿柬固硅吗纤缓秩堑迈迸CAS9技术CAS9技术TypeII基因座以产脓链球菌的典型TypeIICRISPR/Cas为例,其基因座结构可分别三部分,5'端为tracrRNA基因。中间为一系列Cas蛋白编码基因,包括Cas9、Cas1、Cas2和Csn2。3'端为CRISPR基因座,由启动子区域和众多的间隔序列(spacers)和重复序列(repeats)顺序排列组成。懊鞘枣掣控玻衫卒禹猛均府板息锰肌尖冰闺莆食鲁亢邵里捷勒皑妒帘吱西CAS9技术CAS9技术Cas9proteinfunctionCasnucleasehas:①RNAbindingdomain;②anα-helicalrecognitionlobe;③aPAM-interactingsite.④anucleaselobe:NHN:负责切割与crRNA互补的链RuvC:负责非互补链的切割因此,将RuvC或是NHN活性突变后Cas9只有单链切割活性,类似于切口酶害贴沪莫骸斜垄捂嘲寝掂如塌想灸咆劣湛裴矫级科勿犬酸畴毛县曼毫哄汪CAS9技术CAS9技术Adaptiveimmunityinvolvesthreephases(作用机理)(1)CRISPR的高度可变的间隔区的获得:外来入侵的噬菌体或是质粒DNA的一小段DNA序列(protospacer)被整合到宿主菌的基因组,整合的位置位于CRRSPR的5'端的两个重复序列之间(repeats)。(2)CRIPSR基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工):CRISPR基因座首先被转录成前体CRISPRRNA(pre-crRNA),然后由tracrRNA指导,在Cas蛋白或是核酸内切酶的作用下被剪切成一些小的RNA单元,这些小RNA即为成熟crRNA,(3)CRISPR/Cas系统发挥活性,对外源遗传物质的干扰:成熟的crRNA与特异的Cas蛋白形成核糖核蛋白复合物,再与外源DNA结合并扫描到外源DNA,寻找其上的靶序列,crRNA的间隔序列与靶序列互补配对,外源DNA在配对的特定位置被核糖核蛋白复合物切割。佃离凰提球奋勿岂臂屈资咨园玲镁蓑诗耽眯钟探辩饮赘铱跳雹亦销蝇挨富CAS9技术CAS9技术PAM(protospacer-adjacentmotif)PAM是由3个成对碱基构成的序列,靠近靶DNA序列3’末端,可以促进靶序列的识别。化脓链球菌Cas9作为基因组修饰通用的工具,特异识别NGG和NAG的PAM序列(前者效率更高)。RNA-DNA异源双链体的形成是从PAM位点开始的,从而使得Cas9发挥活性,对DNA链进行切割。独洲逃居师衡炼鳃繁询辱艳核褂娠泥寸蒲拙瓶职狐委乖谨诊弗是木抗硷燥CAS9技术CAS9技术避免细菌自身免疫的发生宿主菌利用crRNA与靶序列配对结合介导外源DNA切割,而crRNA本身是由宿主菌的基因组为模板转录出的pre-crRNA经加工后形成的,这就是说相同的靶序列也存在于宿主的基因组中,那么CRIS