文档介绍：考马斯亮蓝法测定(实验报告记录)————————————————————————————————作者:————————————————————————————————日期: 考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量吴凡郭梦雨摘要:本实验以苹果果肉为研究对象,采取考马斯亮蓝比色法测定蛋白质的吸光度值,通过对果实可溶性蛋白提取缓冲液、缓冲液浓度、pH值、外源添加物对果肉可溶性蛋白提取效率的影响的研究,优化苹果果实可溶性蛋白含量测定方法,以期优化果实可溶性蛋白测定条件,为客观反映果实可溶性蛋白水平提供一种可行的方法。结果表明:外源添加PVP和EDTA以是苹果可溶性蛋白提取率的主要影响因素。-HCl提取缓冲液(内含1mmol/LEDTA和1%PVP),%。关键词:苹果、考马斯亮蓝法、Tris-HCl缓冲液、(solubleproteincontent)是一个重要的生理生化指标,也是果蔬品质和营养的重要评价指标之一。许多可溶性蛋白是构成果蔬中酶的重要组成部分,参与果蔬多种生理生化代谢过程的调控,与果蔬的生长发育、成熟衰老,抗病性、抗逆性密切相关。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色,最大光吸收在465nm,当它与蛋白质结合后变为蓝色,最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内,蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比,通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度高,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1000μg/mL,,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。但该方法线性范围窄,需要选择适宜的提取缓冲液及缓冲液浓度、pH值和外源添加物等,以使测定方法有较高的灵敏度,测定值与真值相近。、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、乙醇、85%磷酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、乙二胺四乙酸(EDTA)、聚乙烯比咯烷酮(PVP)、NaCl、MgCl2、抗坏血酸、半胱氨酸、β-巯基乙醇。(25mL10个、100mL1个、500mL1个、棕色瓶1个、分析天平、胶头滴管、烧杯(50mL2个)、移液管(20mL)、量筒(10mL1个、25mL1个)、研钵、移液枪(1000μL)UV-1800型紫外-可见光分光光度计日本岛津公司;旋涡混合器;PH计。(100μg/mL牛血清白蛋白):称取牛血清蛋白25mg,加水溶解并定容至100mL,吸取上述溶液40mL,用蒸馏水稀释至100mL;:称取50mg考马斯亮蓝G-250,溶于25mL90%乙醇中,加入50mL85g/100mL的磷酸,再用蒸馏水定容到500mL,摇匀,贮于棕色瓶中;:、、、、、、、、-HCl缓冲液(100mmol/L);-HCl缓冲液():10、30、50、80、100mmol/L;:乙二胺四乙酸(EDTA)(1mmol/L)、聚乙烯比咯烷酮(PVP)(1g/100mL)、NaCl()、MgCl2()、抗坏血酸(2mmol/L)、半胱氨酸(2mmol/L)、β-巯基乙醇(2%,V/V)。-250溶液及其蛋白反应液全波长扫描取3mL配制好的考马斯亮蓝G-250溶液或其与蛋白反应液,置于1cm光程玻璃比色皿中,以紫外分光光度计在400~800nm范围内进行扫描,确定考马斯亮蓝G-250溶液和其蛋白反应液的最大吸收峰和空白吸收值。,按表1加入标准蛋白质溶液和蒸馏水,混匀后,向各管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液。每加完一支试管,立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈,以免产生大量气泡而难于消除)。混合后静置5min左右,以0号试管为空白对照,在595nm波长处测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标,以吸光度为纵坐标绘制标准曲线,求得线性回归方程表1绘制标准曲线的各试剂添加量项目管号012345100μg/mL牛血清白蛋白溶液/