文档介绍：质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告记录————————————————————————————————作者:————————————————————————————————日期: 质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、;;;;。二、(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下,可以DNA为模板,以特定引物为延伸起点,以dNTP为原料,通过变性、退火、延伸等步骤,在体外(缓冲液中)复制DNA,使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。PCR一次循环的具体反应步骤为::加热反应系统至95℃,使模板DNA在高温下完全变性,双链解链。:逐渐降低溶液温度,使合成引物在低温(35-70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右),与模板DNA互补退火形成部分双链。:溶液反应温度升至中温72℃,在Taq酶作用下,以dNTP为原料,引物为复制起点,模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。(1).碱裂解法:染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异:,染色体DNA和质粒DNA均变性;,变性的质粒DNA复性并保存在溶液中,染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,可通过离心形成沉沉淀去除。(2).离心层析柱:、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA,而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质;;,高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。质粒DNA的定量分析(紫外分光光度法):,且其对光的吸收是具有选择性;:;A260/A280=<(芳香族)或酚类物质A260/A280>,用RNA酶去除。质粒DNA的酶切鉴定:限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合,或是与其附近的特异位点结合,并在结合位点切割双链DNA。琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应:不同的DNA,分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).三、材料与方法:(一)实验材料::PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管材料:菌液【大肠杆菌DH5a菌株(pMD19-T质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白GFP)】、无菌去离子水、2×PremixTaq、:恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管材料:溶液P1(S1)、溶液P2(S2)、溶液P3(S3)、去蛋白液PE(W1)漂洗液WB(W2)、洗脱液EB(Eluent)、含pMD19-(紫外分光光度法)仪器:比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪材料:蒸馏水、:、微量加样枪材料:无菌水、10×M酶切缓冲液BufR、质粒DNA、HindIII(15U/ul)、EcoRI(12U/ul):凝胶电泳系统、凝胶成像系统材料:电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNAMarker5000、电泳缓冲液(二)实验方法准备目的DNA:菌液煮沸10min,冷冻, ml PCR反应管一只,用微量加样枪按下述顺序分别加入:、2*、引物1(10mol/L)1μl、引物2(10mol/L)1μl、菌液5μl将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心将装有PCR反应体系的PCR反应管放入PCR仪上进行如下操作:①94℃预变性5分钟后开始以下循环②循环为94℃—