文档介绍：人心肌肌酸激酶MB同功酶的克隆及原核表达李子颖作者单位:原子高科股份有限公司(北京102413);2中国食品药品检定研究院(北京100050);3中国原子能科学研究院通讯作者:李子颖,E-mail:ciaelee@,贾娟娟2,刘一兵1,韩世泉3【摘要】目的构建人肌酸激酶MB同工酶的原核表达系统,纯化重组酶蛋白并检测其活性。方法从购买的含CKM、CKB基因片段的质粒中扩增人肌酸激酶M、B亚基基因,构建pGEX-4T-1-(DE3)GST原核表达系统。以异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。利用重组蛋白的GST标签亲和层析纯化。结果重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定与预期相符,诱导表达后细菌裂解液纯化后SDS—PAGE在分子量110,000(CKMB)处显示单一蛋白条带,采用酶联免疫分析的方法进行免疫活性实验,所得的蛋白和CKB、CKM抗体都有免疫结合。结论成功表达并纯化了人肌酸激酶MB同工酶。【关键词】:人肌酸激酶MB同工酶;原核细胞;基因表达Cloningandprokaryoticexpressionofhumncreatinekinase-MBisoenzyme(CK-MB)LiZi-ying*,JiaJuan-juan,LiuYi-bing,HanShi-quan(*AtomHighTechCo.,Ltd.,Beijing,102413,China)【Abstract】hewholegeneofhumancreatinekinaseMBisoenzyme(CK-MB)ells,binantCK-MBanddetermineitsantigen-、CKBgenewereamplifiedfromplasmidweboughtandinsertintoprokaryoticexpressionvectorpGEX-4T--4T-1-(DE3),thendeterminedantigen-、binantpGEX-4T-1--ellsandpurified.[Keywords]Humncreatinekinase-MBisoenzyme;ells;Geneexpression急性心肌梗死(acutemyocardialinfarctionAMI)患者存活率的关键是早期快速诊断,因为心肌细胞在梗死6h后通常不可逆转。对于诊断急性心肌梗死(AMI),目前心肌标志物中的肌酸激酶(creatinekinaseMB,CK-MB)质量被视为诊断急性心肌梗死较敏感的指标之一[1]。肌酸激酶同工酶CK-MB主要存在于心肌细胞中。急性心肌梗死(AMI)时心肌细胞受损,膜的完整性和通透性改变,使细胞内的大分子逸出,能在外周血中被检测到。这些大分子物质被称为心肌损伤标志物。在这些心肌标志物中CK-MB是升高较早,上升幅度较大的一种酶,也是迄今为止诊断AMI最佳且临床上应用最广泛的血清酶指标之一。AMI后CK-MB于4h升高,16~24h达高峰,48~72h恢复正常,其升高程度能较准确地反映梗死的范围,其高峰出现时间是否提前有助于判断溶栓治疗是否成功[2-4]。目前CK-MB质量的检测是采用免疫分析的方法,需要使用大量高质量的标准品和抗体[5-7]。由于人CK-MB天然来源的有限性,通过基因工程重组CK-MB来制备高质量免疫原和标准品成为重要的途径[8-11]。材料与方法质粒、菌株及细胞原核表达载体PGEX-4T-1(含GST标签)本实验室保存;过渡载体pEASY-Bluntsimplecloningkit和感受态Trans-TOP-1、(DE3)购自TransGen公司,含CKM、CKB基因序列的质粒SC319293、SC119007购自Origene公司。主要试剂及仪器PCR产物纯化试剂和胶回收试剂购自TaKaRa公司;质粒提取试剂盒购自Promega公司;限制性内切酶Nd