文档介绍：NurfürdenpersönlichenfürStudien,Forschung,,当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为CRISPR结构的时候,他们并没有预料到这会给基因编辑世界带来一场风暴。在过去的这一年半时间里,CRISPR方法已迅速席卷了整个动物王国,成为DNA突变和编辑的一种“马上”技术——迄今为止在几乎每种实验细胞类型中都能起作用,包括人类细胞,小鼠,斑马鱼和果蝇细胞;这种技术也易于操作,已经有两个研究组利用CRISPR分析了人类细胞中几乎每个基因单突变(详细报道 Science:CRISPR/Cas9加速基因挖掘;Science:张峰建立CRISPR/Cas9人细胞敲除体系)。就在最近,CRISPR还帮助研究人员完成了携带特殊基因中断(genedisruptions)的工程猴,这项壮举此前曾在小鼠中实现过,但未在灵长类动物中完成过(详细报道Cell:中国科学家利用CRISPR/Cas9技术构建基因工程猴)。CRISPR本身是一种防御系统,用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的CRISPR位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子RNA。当微生物感染了这些病毒中的一种,CRISPRRNA就能通过互补序列结合病毒基因组,并表达CRISPR相关酶,也就是Cas,这些酶都是核酸酶,能切割病毒DNA,阻止病毒完成其功能。将CRISPR/Cas系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件:一个Cas酶,用于切断靶标DNA,比如目的基因中的DN***段,另外一个就是称为导向RNA(gRNA)的RNA分子,这种分子能通过互补结合靶标。gRNA也就是细菌细胞中CRISPRRNA的一个更短的版本,它能与Cas形成复合物,指导Cas到达正确的剪切位点。不过研究人员也可以通过结合其它元件,或者改变Cas活性,来调整这种工具在基因校正和基因调控方面的作用。“目前,非传统基因编辑应用方面的生物学家利用一种新工具,分析细胞中,和整个生物机体中突变的作用”,来自加州大学伯克利分校的生物化学教授JenniferDoudna表示,她与她的同事解析了细菌细胞中CRISPR的作用机制。近期,Doudna研究组利用这种工具,首次通过小鼠受精卵基因编辑构建了敲除小鼠。不过CRISPR技术也存在一个主要的缺点,那就是缺乏特异性:一些gRNA分子结合的DNA只是部分与gRNA互补。在这一方面,其它基因编辑方法,如锌指核酸酶(ZFN)和TALENS可能要比Cas-gRNA更为具有优势,因为这两者需要识别更长的靶标DNA序列。但是ZFN和TALENS方法在克隆和细胞表达方面要比gRNAs难得多,而且研究人员通常还需要验证十几个不同的TALENS,以及几十个不同的ZFNs,来证明其中一个有效。近期《科学家》(TheScientist)杂志汇总了基因编辑过程中Cas和gRNA的处理过程及解决方案,用于帮助新接触这一技术的研究人员熟悉这项热门技术。如何CRISPR我的靶标?由于CRISPR系统并不复杂,因此我们所要做的就是将带有质粒(能表达Cas和gRNA)的细胞进行转染。研究人员可以采用一种Cas的变体,即Cas9,这种酶来自于一种链球菌,由RNA进行指引,能无需其他蛋白的帮助而切割DNA(Science,337:816-21,2012)。Cas9既能切断与gRNA结合的DNA链,也能切断其互补链。目前可以从Addgene购买Cas9质粒(65美元),将其直接转染入细胞。gRNA的长度约为80个核苷酸,包含两个区域:gRNA5'端前20个核苷酸对应于靶标DNA,能结合在靶标DNA上,剩余的约60个核苷酸(gRNA长度取决于表达gRNA的质粒)形成一个发夹结构,这个结构能帮助gRNA与Cas9结合,并由此指导与DNA的结合。gRNA与Cas9一样,也是通过质粒表达的,从Addgene可以购买几种这种质粒(65美元),但是与Cas9不同的是,我们需要自己定制与靶标相匹配的表达质粒。我们可以设计一个编码20个碱基,与靶标DNA结合的片段,将其克隆进表达质粒里(编码gRNA其它部分的60个核苷酸已经在质粒中了)。唯一的设计要求就是,gRNA上要有一个片段,能与由任意核苷酸序列(N)+5'末端两个胞嘧啶核苷酸(-NCC)的DNA结合。这是因为gRNAs似乎与相对链包含两个鸟嘌呤残基(-NGG)的DN***段结合最好,这种-NGG序列也就是PAM结构(protospaceradjacentmotif)。要在靶标DNA区域中挑选合适的20个碱基对,有几个方案可以选择,比如麻省理工学院的CRISPRDesign();德国癌症研究中心开发的E-Crisp(.org