文档介绍：---------------------------------作者:_____________-----------------------------日期::_____________土壤中放线菌的分离与纯化---------------------------------------------------------------------编制:---------------------------------------------------------------------日期:土壤中放线菌的分离与纯化实验目的1掌握放线菌的生长特性,微生物的培养方法。2掌握微生物实验的基本生物技术,主要包括无菌操作技术,纯种分离技术,纯种培养技术,以及抗生素检测等。3掌握合成培养基,选择培养基的制备方法。4学习对微生物实验的中出现问题的分析,解决方法实验材料药品:可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、琼脂、重铬酸钾其他:高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。实验原理放线菌是重要的抗生素产生菌,主要分布在土壤中(主要是链霉菌),其数量仅次于细菌。一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体,为了研究某种微生物,就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来,从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求,常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变,或土壤预先处理(120℃热处理1h),或加入某种抑制剂(如加数滴10%酚等),都可以使细菌,霉菌出现的数量大大减少,从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法,使放线菌在固体培养基上形成单独菌落,并可得到纯菌株。放线菌可以产生抗生素,抑制其他菌种的生长,故可用金黄色葡萄球菌(G+)和大肠杆菌(G-)作指示菌鉴别放线菌。高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基,高氏一号培养基:碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O作为无机盐,FeSO4•7H2O作为微生物的微量元素,•,可溶性淀粉5g,,MgSO4•,FeSO4•,,琼脂5g,水250ml。配制时,先依次加入上述药品(除琼脂外)顺序溶解,加入无菌水至250ml,调节pH=,再加入琼脂不断搅拌震荡至溶化后,121℃灭菌20分钟。将6套平皿、12只试管灭菌。,分装:取6套无菌平皿,在皿底贴上标签,注明土壤稀释液的稀释度(10-3、10-4、10-5)。每个稀释度做两个培养皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷凝至50℃左右的高氏一号培养基15~20ml左右,待冷凝成平板。另取5支盛有9ml一只盛有10ml无菌水的试管,排列于试管架上,依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。 ,即10-1的土壤悬液,静置30s。用无菌吸管无菌操作取10-1浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-2的无菌试管中,并吹吸吸管2~3次,吸时伸入管底,吹时离开水面,使其混合均匀。即为10-2浓度的土壤稀释液。依此类推,直到稀释至10-5的试管中(每个稀释度换1支无菌吸管)。如图 ,倒入溶化后冷却至45℃左右的高氏培养基约10—15ml,置水平位置,迅速旋动混匀,待凝固。(若融化的培养基温度太高,会产生太多的冷凝水,影响观察。) 用1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液1ml,对号放入编好号的无菌培养皿中,每一浓度对应两个平板。用无菌涂布棒(从浓度小液开始)将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀,涂完一个平板用酒精灯灭菌。稀释涂布平板法 4培养接种完毕,将平皿和试管放入28℃恒温箱培养7天,观察平皿上放线菌(主要是链霉菌)菌落。菌种纯化1、倒平板将加热融化的高氏一号合成培养基倒平板,并标号。2、平板划线划线的方法很多,但无论哪种方法划线,其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释,使形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种:图Ⅴ-3划线分离示意图⑴分区划线用接将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态,在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时,用环状接种针在火焰旁刮取少许菌