文档介绍：---------------------------------作者:_____________-----------------------------日期::_____________实验七---DNA的琼脂糖凝胶电泳实验七DNA的琼脂糖凝胶电泳(4学时)实验目的琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法,具有操作方便、经济快速等优点。本实验学****DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术,掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。实验原理   琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法,这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物,利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品,其中有三种构型的分子:cDNA)、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。cDNA>IDNA>ocDNA   核酸分子是***解离分子,,而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离,所以分子带正电,在电场中向负极泳动;-,碱基几乎不解离,而磷酸基团解离,所以核酸分子带负电,在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同,因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时,单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。影响核酸分子泳动率的因素主要是:1、样品的物理性状即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言,电荷密度愈大,泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同,所以对泳动率的影响不明显。对线形分子来说,分子量的常用对数与泳动率成反比,用此标准样品电泳并测定其泳动率,然后进行DNA分子长度(bp)的负对数 ——泳动距离作标准曲线图,可以用于测定未知分子的长度大小。DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大,比如质粒分子,泳动率的大小顺序为:cDNA>IDNA>ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响,会出现相反的情况。2、支持物介质核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰***凝胶两种介质,琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同,是于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰***凝胶由丙烯酰***(Acr)在N,N,N′-四***乙四***(TEMED)和过硫酸铵(AP)的催化下聚合形成长链,并通过交联剂N,N′-亚甲双丙烯酰***(Bis)交叉连接而成,其网孔的大小由Acr与Bis的相对比例决定。琼脂糖凝胶适合分离长度100至60的分子,而聚丙烯酰***凝胶对于小片段(5bp-500bp)的分离效果最好。选择不同浓度的凝胶,可以分离不同大小范围的DNA分子。3、电场强度电场强度愈大,带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小,所以电泳时一般采用低电压,不超过4V/cm。而对于大片段电泳,-。进行高压电泳时,只能使用聚丙烯酰***凝胶。4、缓冲液离子强度核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统,但它们各有利弊。TAE价格低廉,但缓冲能力低,必须进行两极缓冲液的循环。TP