文档介绍：一、培养细胞常用配置培养基的配置:基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml冻存液的配置:10%DMSO+90%胎牛血清依次比例酌量配置。超净工作台常规配置移液器1套(、20μl、200μl、1ml),酒精灯1盏,液器1台,斜架1台,酒精喷壶1个,酒精棉球缸1个,污缸1个,常规耗材:培养瓶(50㎝2),定量移液管(5ml、10ml),枪头(1ml、200μl、10μl),培养皿,6/24/48/96孔板,医用脱脂棉球,冻存管所需试剂:培养基,胎牛血清,双抗,DMSO,胰酶,75%酒精……实验前准备:所需的各项高压后的耗材及污物缸放于超净工作台内,用酒精喷壶喷洒实验台面,并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。培养基及胰酶恢复常温后使用,可37℃水浴5-10min二、细胞复苏步骤:,开启超净台正常工作状态,用酒精消毒操作者的双手。(DMEM),恒温水浴箱37℃预热20min,备用。超净台内准备一支15ml离心管备用。,点燃酒精灯,再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次,旋开瓶盖后需再次分别消毒瓶口和瓶盖。,立即放入37℃水浴中,快速摇晃,直至冻存液融化至黄豆粒大小后迅速取出。,缓慢加入4ml培养液,离心(1000r/min,5min)。(复苏日期等),提前加入5-10ml培养液;离心结束后用1ml培养液悬液混悬沉淀细胞后分别加入培养皿内。-3次后拧紧,熄灭酒精灯,整理实验台面,取出实验试剂及污缸等,关闭超净工作台。:。此项尤为重要,细胞冻存管可能漏入液氮,解冻时冻存管中的气温急剧上升,可导致爆炸。:冻存液的配置已是常识,在这里不作详述,但二甲基亚砜(DMSO)对细胞不是完全无毒副作用,在常温下,二甲基亚砜对细胞的毒副作用较大,因此,必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢,会造成细胞的损伤,二甲基亚砜(DMSO)最好选择进口产品。。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高,注意加入少量培养液可稀释其浓度,以减少对细胞的损伤。:目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养,第二天换液。因为离心的目的是两个,去除DMSO,去除死细胞,这个是标准流程,但对一般人来说,把握不好离心转速和时间,转的不够活细胞沉底的少,细胞就全被扔掉了,转过了活细胞会受压过大,死亡。此外在操作过程中容易污染,所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜(DMSO),DMSO对细胞有一定的毒副作用,所以须将离心后的液体前倒净,且一定倒干净。-:复苏1管细胞一般可分装到2-3只培养皿中,分装过多,细胞浓度过低,不利于细胞的贴壁。:这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度,从如果你加培养基的太少,那么DMSO的浓度就会比较大,就会影响细胞生长,从以前的资料来看,%的时候对一般细胞没有什么影响,还有一个说法是1%。所以如果你的冻存液的浓度是10%:在不加任何条件下直接冻存细胞时,细胞内和外环境中的水都会形成冰晶,能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等,能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂,可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下,能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快,使之迅速通过细胞最易受损的-5~0℃,细胞仍能生长,活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜(DMSO)和甘油,它们对细胞无毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞。三、,开启超净台正常工作状态,用酒精消毒操作者的双手。(DMEM),恒温水浴箱37℃预热20min,备用。,点燃酒精灯,再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次,旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖。,,在酒精灯上灼烧尾部后装于移液器上,再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次,悬空进入培养基瓶内吸取5-10ml培养基再悬空移入培养皿内,将培养皿盖在酒精灯上