文档介绍：(blotting)是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年,Southern建立了将DNA转移到***纤维素膜(NC膜)上,并利用DNA-RNA杂交检测特定的DN***段的方法,称为Southernblotting。之后,JamesAlwine、eStark三位教授又发明了RNA杂交检测技术,因与Southernblotting相似,故命名为Northernblotting。eStark这位教授在两年后又开发出类似的蛋白质检测方法。1981年,te所著的AnalyticalBiochemistry中,首次将单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Westernblotting。此后开发的Easternblotting是Westernblotting的变形,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Easternblotting。30年来,Westernblotting技术已成为蛋白质研究中最常用的工具,用于鉴定目的蛋白是否存在样品当中,蛋白质的表达情况(上调或下调表达)和不同的样品之间的表达差异性。。目的基因被克隆到pET质粒载体上,受噬菌体T7强转录及翻译信号控制;表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。T7RNA聚合酶机制十分有效并具选择性:充分诱导时,几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白;诱导表达后仅几个小时,目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。,定性(或定量)检测苦荞黄***醇合酶基因(Flavonolsynthasegene,FtFLS)在大肠杆菌表达宿主菌EscherichiacoliBL(DE3)中的诱导表达。***醇合酶(FLS,)属于2-ODD家族,催化黄***醇合成支路中最后一步氧化反应,也是直接合成黄***醇的反应。FLS可以使二氢黄***醇在C3链中C2和C3之间氧化形成双键,从而生成黄***醇:aDihydroflavonol+2-oxoglutarate+O2aFlavonol+inate+CO2+H2O。本实验采用PCR的方法,在苦荞黄***醇合酶基因(FtFLS)ORF起始密码子前引入Kpn?酶切位点,去掉终止密码并引入BamH?酶切位点。克隆引入酶切位点后的FtFLS到表达载体pET-30b(+)质粒中,其表达产物分别在N-末端和C-末端各含有6×His标签。重组质粒(pET-30b(+)-FtFLS)(DE3)并使用IPTG进行诱导表达。收集诱导0h、2h、4h、6h和8h的产物,经SDS-PAGE后用于考马斯亮蓝R-250染色或Westernblotting分析。Westernblotting的标准流程如下:蛋白质首先通过SDS-PAGE***凝胶电泳分离,通过电泳转移到固相支持物上(***纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜);将膜上未反应的位点封闭起来,以抑制抗体的非特异性吸附,固定的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用并通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体(Anti-HistagIgG,一抗)与重组FtFLS