文档介绍：***化检测***化研究方法学回顾1整体水平***化分析HPLC)(HPLC)及相关方法HPLC是一种比较传统的方法,能够定量测定整体水平DNA***化水平。它由Kuo等1980年[18]首次报道。过程是将DNA样品先经盐酸或氢***酸水解成碱基,水解产物通过色谱柱,结果与标准品比较,用紫外光测定吸收峰值及其量,计算5mC/(5mC+5?)的积分面积就得到基因组整体的***化水平。这是一种检测DNA***化的标准方法。但它需要较精密的仪器。Fraga等2002年[19]运用高效毛细管电泳法(HPCE)处理DNA水解产物,以确定5mC的水平。HPLC相比,与HPCE更加简便、快速、经济。HPLC及HPCE测定整体DNA***化水平的敏感性均较高。Oefner等1992年[20]提出变性高效液相色谱法(DHPLC)用于分析单核苷酸和DNA分子。邓大君等2001[21]将其改进与PCR联用建立了一种检测***化程度的DHPLC分析方法。将重亚硫酸盐处理后的产物进行差异性扩增,由于原***化的在重亚硫酸盐处理时仍被保留为胞嘧啶,因此原***化的在PCR扩增时,其变性温度也相应上升,使PCR产物在色谱柱中保留的时间明显延长,这样就可以测定出PCR产物中***化的情况。这种方法的最明显优点是:可用于高通量混合样本检测,能够明确显示目的片段中所有CpG位点***化的情况,但不能对***化的CpG位点进行定位。***转移酶法[22]***转移酶法[22]SssI***转移酶能够催化DNA的CpG位点发生***化。3H-S腺苷甲硫氨酸(3H-SAM)在SssI***转移酶催化作用使基因组DNA的CpG位点发生***化。通过测定剩余的放射性标记的SAM即可得到原整体***化水平,即测到的放射性强度与所测DNA***化水平成反比。这种方法的缺点是所使用的SssI***转移酶不稳定,致结果不够精确。-免疫化学法[23][23]这种方法是基于单抗体能够与5mC发生特异性反应。应用荧光素标记抗体使之与预先已固定在DEAE膜上难特异性结合,对DEAE膜上的荧光素进行扫描得到5mC的水平,其荧光素强度与5mC水平成正比。Oakeley等1997年[23]报道了这种方法。这种方法需要精密的仪器。***乙醛法Oakeley等1999年[24]首先描述了这种使用***乙醛和荧光标记的方法。首先,将DNA经重亚硫酸盐处理使未***化的胞嘧啶全部转变为尿嘧啶,而***化的胞嘧啶保持不变(Frommer等1992年)[25],然后经过银或色谱柱去除DNA链上的嘌呤,再将样品与***乙醛共同孵育,这样5mC就转变为带有强荧光的乙烯胞嘧啶,荧光的强度与原5mC的水平成正比。这种方法可以直接测定整体5mC水平。其优点是所用试剂价格低廉且稳定性好,避免了放射性污染,但缺点是费时费力,而且***乙醛是一种有毒的物质。2特异性位点的DNA******化敏感性限制性内切酶(methylation-sensitiverestriction***化敏感性限制性内切酶(methylation-sensitiveEndonuclease,MS-RE)Endonuclease,MS-RE)-PCR/Southern法这种方法利用***化敏感性限制性内切酶对***化区的不切割的特性,将DNA消化为不同大小的片段后再进行分析。常使用的***化敏感的限制性内切酶有Hpa?-Msp?(GG)和Sma?-CGGG)等。由于后者识别的碱基数相对较多,其碱基序列在体内出现的概率相对较低,所以以前者即Hpa?-Msp?更常用。其中Hpa?和Msp?GG序列,然而当序列中的胞嘧啶发生***化时,Hpa?不切割,利用Hpa?-Msp?的这种属性处理DNA,随后进行Southern或PCR扩增分离产物,明确***化状态[12][26]。这是一种经典的***化研究方法,其优点是:相对简单,成本低廉,***化位点明确,实验结果易解释;缺点是:,因此非该序列中的CG将被忽略;***化状态时,该检测方法的结果才有意义;,Southern方法较复杂,且需要样本的量大;;。[25]提出的研究DNA***化方法。过程是:重亚硫酸盐使DNA中未发生***化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而***化的胞嘧啶保持不变(见图1),行PCR扩增所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶,最后,对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点发生***化。此方法是一种可靠性及精确度很高的方法,能明确目的片段中每一个CpG位点的***化状态,但需要大量的测序,过程较为繁琐、昂贵[27]。图1