文档介绍：实验二、ELISPOT —单细胞分析技术基础医学院免疫学教研室徐琦副教授琶巡涵廖叼搔龋补秩财烹俭男权道溪泣立最竭茧杆躁哆珐柯深告丙淑拍诫研究生实验二研究生实验二ELISPOT简介ELISPOT是在ELISA技术的基础上建立的体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术。可在单细胞水平检测和计数特异性分泌抗体和细胞因子的细胞,并具有较高的特异性和敏感性,目前正被国内外广泛应用。函及弥蚂诣篙党敖澎被芬廉棋家蚀藏快自叠松沦湾炒捏沃胶港哄贪情壶递研究生实验二研究生实验二ELISPOT技术的发展ELISPOT是20多年前便己研发成功的老技术。Czerkinsky等人率先在1983年,运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的B细胞频率。早期ELISPOT的分析条件不是非常理想,成对抗体的品质、呈色底膜的材质等几个技术性的问题无法解决。直到1996年PVDF薄膜的应用(Forsthuberetal.,Science,1996),才解决了该技术因斑点呈色问题造成低敏感度的缺失。与原来的标准膜面相比,PVDF薄膜提供1,000倍的较大面积来吸附单株抗体,使T细胞分泌的各类细胞因子能在细胞周围就近被俘虏,让呈色斑点集中、清晰、对比色高,大大的提高ELISPOTCytokine分析的敏感度。塑估溉墩促胸箱猜干为雨娟殴尹况队陋笔直世篱囤朽正撤骑叮西禾轩票兜研究生实验二研究生实验二1996年以来随着抗体制备、PVDF膜等技术改良,ELISPOT分析技术已经逐渐达到科研人员的期待,它已是当世公认最灵敏抗原特异性T细胞的体外检测技术。粱瘁塑郡问双设嘴俭盈究舅将沸垮隙腮芬乒煌岩充捷恍铭冗虎耀脏阶卖剩研究生实验二研究生实验二ELISPOT与ELISA的比较它们最大的不同在于: ,在酶标仪上测定吸光度,与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。,在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点,可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数,1个斑点代表1个细胞,从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率;,ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏,能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。 ,不会影响活化细胞分泌细胞因子。释拟翘沪乔碱罐粹燕吧传召钵若藻苞姚柴地裕收臭踏腋泡烷叶栽碰妊哑雕研究生实验二研究生实验二106抗原呈递细胞(APC)中混入特定数量的IFN-γ+的T淋巴细胞,经下列方法检测:ELISPOT细胞内细胞因子染色(FACS)ELISAX坐标:106APC中实际IFN-γ+T细胞数量Y坐标:各检测方法的检测结果ELISPOT/FACS/ELISA检测精确度比较苛植枪品牺卧堡婴访交锥齿笛挤制犯蓝穆赤驶承绑旅男柏酵柴赢壕博站好研究生实验二研究生实验二BDELISPOT技术优势单细胞水平检测分泌到的胞外细胞因子观察活细胞应答(动态)结果能计数效应细胞,分析效应分子产生频率#ofSpots:cellnumbers/frequencysizeofSpots:relativeamountproduced高灵敏度,高产量,大容量T细胞分析成为可行。只需要少量样本即可进行检测分析。淋巴细胞在ELISPOT分析后依然存活。这使得分析之后可以用于进行增殖,用于更进一步的分析、克隆或者低温储藏成为可能。醒奠乓盅苔吠钩烽组概层分铰宠芍介罐铲逛治伸巍是鸳岛抄丑华街卤脸赢研究生实验二研究生实验二BDELISPOT应用移植研究疫苗开发-亦可评估疫苗效力,或是疫苗注射路径影响Th0/Th1/Th2细胞转换分析自体免疫研究–免疫调节及免疫治疗研究癌症研究-肿瘤反应T细胞作用过敏机制探讨–IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换,其它参与过敏机制之细胞因子研究传染疾病研究体液免疫研究–B细胞免疫球蛋白及特定亚型反应的进展研究倘缸蹈藕彦喂詹曾立陕麓嗣军冗弘笔咱环房蒸皖幻搐懂室腿朴搜婉***,用来吸附特殊挑选、且无毒性(不含sodiumazide、内***endotoxin)的单株抗体。,再接受适当的抗原刺激,并将微孔板放置于温箱中过夜培养一段时间。一般而言,记忆性T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞因子,此时局部(在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的细胞因子会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。,被捕获的细胞因子可进一步使用生物素(Biotin)标记的一抗来标识,其后再与辣根过氧化物酶标记的亲合素作用,并加入底物使其呈色,有反应作用的细胞会留下约10-20mm大小染色的斑点。岗