文档介绍：实验二热休克蛋白HSP90的PCR扩增技术一、实验目的与原理简介聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)是体外克隆基因的重要方法,它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获得目的基因,同时完成了基因在体外的克隆,是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。常规PCR用于已知DNA序列的扩增,具体可分为三个主要过程:一、变性。通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂,形成单链DNA分子,温度为94℃,时间1min。二、复性。降低温度使DNA单链分子同引物结合。温度为55℃,时间1min。三、延伸。升高温度,在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP,实现模板的扩增,温度为72℃,时间2min。同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟,使DNA双链完全解开。经过25-35个循环之后,在72℃下继续延伸10分钟。PCR反应包含的七种基本成分:热稳定性DNA聚合酶:TaqDNA聚合酶是最常适用的酶,商品化TaqDNA酶的特异性活性约为80000单位/:寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。脱氧核苷三磷酸(dNTP):标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸,即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间,高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用,可能是dNTP与Mg2+螯合有关。二价阳离子:一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶,由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合,因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg2+。维持PH值的缓冲液:用Tris--,标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时,反应体系的温度将下降1个多单位,。模板DNA:含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合液中,闭环DNA的及增效率略低于线性DNA。实验目的:学****PCR反应的基本原理和基本技术。二、材料和试剂10Х扩增缓冲液4种dNTP贮存液(20mmol/L,)TapDNA聚合酶5端引物(20μmol/L)及3端引物(20μmol/L)模板DNA琼脂糖凝胶移液枪(-10μL5-50μL)枪头实验操作将各成分加到微量离子管内混合::预变性:96ºC5min30个循环:95ºC45min,60ºC45min,72ºC150min;延伸:72ºC10min注:聚合反应时间是根据靶基因的长度按每分钟聚合1000bp的速率来计算出来的。抽取每种扩增样品5-10μl,用琼脂糖电泳来分析扩增结果,用DNAmarker来判断扩增片段的大小。凝胶一般用Goldview染色后观察扩增的量与片段大小。从阳性对照样品的相对分子量的目的条带的亮度与粗细可以判断PCR扩增的效率;阴性对照样品在目的条带附近应该没有相应条带。PCR常见问题及解决方案实验注意事项:对可能发生PCR过程中主要疑难问题的解析问题可能原因解决方法