文档介绍：中国医学科学院博士研究生论文链格孢霉变应原的实验研究中国医学科学院博士研究生论文链格孢霉变应原的实验研究4中国医学科学院博士研究生论文链格孢霉变应原的实验研究链格孢霉变应原的实验研究中文摘要链格孢霉(31ternariaAlternataKeissler)是一种常见的重要的吸入性过敏原,可诱发过敏性鼻炎和支气管哮喘,为了对敏感者进行特异性诊断和治疗,首先要制备高质量的链格孢霉浸出液,为此本作者对链格孢霉的培养、鉴定、提取、分析以及浸出液的2一DE指纹图谱进行了研究。为了叙述方便,按以下五部分分别加以介绍:第一部分:链格孢霉过敏的临床特征及标准血清池的建立我们对2005年8月至2007年5月期间收集到的55例链格孢霉过敏者进行了临床分析,其年龄从6岁至75岁不等,平均为34±17岁,男性为29例,女性为26例。55例中有43例(%)为支气管哮喘,30例(%)为过敏性鼻炎,18例(33%)为过敏性鼻炎合并有支气管哮喘,这些患者的发病季节多为夏季。为了进行链格孢霉致敏蛋白的分析,我们从上述55例中选择了20例患者,构建标准血清池。第二部分:链格孢霉菌种的收集、培养和鉴定本实验的链格孢霉是从空气曝皿中收获的菌种,然后进行提纯培养,对于后者应用常规的形态学和分子生物学鉴定。形态学鉴定显示所培养的真菌生长7d后,呈灰黑色至黑色,分生孢子呈倒棒形或卵形。分子生物学鉴定:为了提高链格孢霉浸出液的制备水平,在必要时需采用分子生物学的办法进行鉴定;本研究应用PCR对所培养真菌的26SrDNA进行扩增后,通过Genebank进行比对,与链格孢霉相似性达9996以上。通过形态学和分子生物学的鉴定,证明它与链格孢霉有高度一致性。其拉丁文为alternariaalternataKeissler,其标准中文名为链格孢霉或交链格孢或互隔链格孢;本文统一采用链格孢霉。第三部分:链格孢霉变应原提取方法的研究为了探索最有效的链格孢霉变应原的提取方法,对新鲜培养的链格孢霉菌苔S中国医学科学院博士研究生论文链格孢霉变应原的实验研究按4种不同的方法进行提取,分别为研磨器研磨、液氮研磨、研磨器研磨&超声破碎、液氮研磨&超声破碎(LNU);对所得到的4种浸液应用Bradford法及SDS-PAGE进行分析,并用RAST抑制试验测定变应原活性。结果显示:不同提取方法提取新鲜培养的链格孢霉菌苔,经LNU所得到的变应原浸液,蛋白质含量最高、蛋白条带最多,在l{AsT抑制试验中达到50%抑制所需蛋白含量是最低的。据此我们认为在对于链格孢霉来说,LNU是较好的提取方法。第四部分:SDS-PAGE免疫印迹分析为了明确链格孢霉变应原浸液的致敏蛋白,本实验通过对LNU法提取的链格孢霉变应原浸液进行免疫印迹分析。研究结果显示:经SDS-PAGE免疫印迹分析显示,有7条蛋白条带能与链格孢霉特异性IgE结合,分子量分别为92KD、B7KD、67K1)、53KD、45KD、29KD、22KD;7种致敏蛋白中,有3种主要致敏蛋白,这些蛋白能被一半以上的病人血清所识别,它们的分子量分别为92KD、53KD、22KD。第五部分:链格孢霉变应原浸液双向电泳的研究为了解决链格孢霉浸液的鉴定问题,我们还应用双向电泳及免疫印迹的方法分析其致敏蛋白。结果显示:通过双向电泳发现链格孢霉浸液中有1450±35个蛋白点,经2一DE免疫印迹分析发现有6个免疫活性的蛋白点,由于双向电泳图谱具有高度的特异性,作者建议可将双向电泳作为链格孢霉浸液鉴定的指纹图谱。此项工作有待进一步研究。关键词链格孢霉RAST抑制试验SDS—-,alternariaalternatawascultured,identified,extracted,analyzedandfingerprintedbytwo-:Clinicalfeatureofpafien协whoaresensitivetoalternariaalternata缸studiedandstandardpooledsenlmiscollectedInordertostudythedinicalfeatureofthepatientswhoalese