文档介绍：中山大学
博士学位论文
16HBE polβ基因的RNA干扰及其在氢醌、甲醛攻击下的毒理学
效应分析
姓名:胡大林
申请学位级别:博士
专业:卫生毒理学
指导教师:庄志雄
20060501
基因的扇及其在氢醌、甲醛攻击下的毒理学效应分析卫生毒理学博士研究生:胡大林导师:庄志雄教授摘要鹕诵薷椿蛭痪踊肪郴蜃榧苹笥畔瓤悸堑幕肪秤Υ鸹近年来,分子生物学研究中的基因阻断技术发展迅速,其中与基因沉随着工农业生产的飞速发展,环境化学性污染物对人群健康的损伤倍受各方面的广泛关注,氢醌降拇徊和甲醛就是其中的典型代表。近年来,化妆品和装饰材料涉及到氢醌和甲醛中毒的案件急剧上升,而目前,二者的毒理学效应和机制又尚未完全阐明。的首位,·酆厦窧基因就是其中之一“。目前认为,墓δ苤饕I婕凹罨谐薷,即填补由碱基切除所产生的非常短的核苷酸缺口;同时,还可能参于粗啤⒅刈椋牖蜃榈奈榷ㄐ缘让切相关,但其与环境化学性污染物所致鹕酥涞墓叵涤写诮徊窖芯,一¨
本研究运用了技术阻断主要研究内容和方法騌干扰用的绿色荧光蛋白载体重设计并合成用于扇诺膁,通过重组筛选、扩增后抽提质粒,运用三、经扇藕蟮细胞一的生物学性状分析。以细胞形态学、细胞生长曲线、细胞周期及软琼脂糖恶性程度鉴定实验等考默现象的发现,为人们所感兴趣的“明星事件”,作为一种高效、特异的基因阻断技术,技术正广泛运用于基因治疗、功能基因组研究、药物筛选、病毒感染研究、信号传导途径研究及分子毒理学研究等领域“。谌酥苌掀は赴中的表达,以探索人毕菹赴纳镅宰醇捌湓谇怩ê图兹┑然肪郴晕廴疚攻击下的毒理学效应,为虻墓δ苎芯考扒怩ê图兹┑亩咀饔机制探索提供基础资料。一、运用分子克隆技术构建组子“狢籶一薄依据腥藀騝蛄擞胐技术将寺〉胶藀启动子的—逆转录病毒载体,经转化、虰消化并回收“籨”目的片段,再将“籨”亚克隆到狢希瘛皃—一籨”重组子,并进行酶切鉴定和序列分析。二、运用载体介导的扇偶际醢邢蛞种苝蛟中的表达。以脂质体转染法将构建好的载体重组子“狢籶一钡既,同时以空白细胞和空载体“狢弊H鞠赴鞫哉帐笛椋辉诰璆秆『螅以荧光显微成像技术观察细胞的转染效果;以蛋白印迹法拥鞍姿椒治鰌虻囊种菩вΓ灰允凳庇ü舛縋技术从水平分析谋泶镆种啤猼
式细胞技术分析不同浓度甲醛对榘芷诘挠跋欤灰許际醴治察狟匍胞的生物学性状改变。以单细胞凝胶电泳技术分析不同浓度对狟一细胞的鹕诵单链具合成,每条链均为担嘶鸷蠹椿袼垂押塑账醖。四、狟一在不同浓度氢醌攻击下的毒理学效应分析。以不同浓度氢醌对处对数生长期的幌赴径还鄄烊毒后的细胞形态学改变:以ǚ治霾煌ǘ鹊腍—坏南赴拘裕应。五、以不同浓度的甲醛对幌赴径荆治銎涠纠硌вΑ以不同浓度甲醛对处对数生长期的幌赴径还鄄烊径竞蟮细胞形态学改变;以ǚ治霾煌ǘ鹊募兹┒—坏南赴拘裕灰粤不同浓度甲醛对幌赴腄损伤程度。结果一、騌干扰绿色荧光蛋白载体重组子“狢籶一构建。甦寡核苷酸链的设计、合成与退火从中检索出人基因全长序列渥艹ざ为擞妹拦鶥镜膁设计软件,设计两端分别含虴拗菩悦盖形坏愕幕ゲ构押塑账崃矗刻:籆一跋嘤Φ膖:一’和位于二者之间的发夹结构:籘。,由上海生工生物工程有限公司—
对膒猂靥澹应,获“——籨”重组子,于一。保存备用。惺芴赴闹票浮⒆;⑸秆⒗┰觥⒅柿3樘峒懊盖屑罯!!V滴..,,取//一畃猂孀B疾《.。用富撼逡海琌./藓塑账崦竔连接酶,构成总体积为牧臃从μ逑担椅路定摇菌扩增甤ǔ蛄腳吧杓频膕所处位置娇蚰..甤!图簆
双酶切上述“—~籨”质粒,回收肙公司质粒抽提试剂盒进行质粒抽提,再作期的甇处发现了白色亮带,双酶切电泳分析在Ψ⑾至四康墓押塑账以含胎牛血清和双抗的培养基ヅQGァ⑶嗝顾豂痬数生长期的细胞以细胞铺板在含血清不含双抗的正常生长培养基中,使其在转染时密度为%;转染时使用无血清、无双抗的培养基,每℃胄锨澹釉だ涞腖撼逡海鲜隽硬铩皃猂猵一弊;,次日挑选阳性菌落扩增;运用盍解法抽提质粒和电泳鉴定;再作虰双酶切鉴定。结果证实抽提到的质粒为“——籨”目的质粒。.狢靥逖强寺运用含舳拥墓押塑账崮康钠巍皃一保煌倍詐—载体进行双酶切;再将目的片段“籨”亚克隆至狢靥澹重组子命名为“狢籶一薄摹皃—一籨”转化、秆⒗┰觥试剂盒法质粒抽提、酶切鉴定及序列分析。运用上述所获“狢籶一敝刈樽幼;,挑选阳性菌落摇菌扩增至。。,并以ㄓ靡籆一灾刈樽又械哪康钠谓行蛄蟹治觥=峁谠的白色亮带,序列分析结果提示与所设计的押塑账嵝蛄型耆恢拢な押塑账崧躺ü獾鞍自靥宓墓菇ǔ晒Α二、载体介导的虻陌邢騌干扰链霉素/Ⅲ
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