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天冬氨酸酶甤诤媳泶镅芯任慧颖栊【,,浙江杭州;掠嘌г阂窖в肷蒲аг海餍掠惶於彼崦珽..是一种蓖要的工业用酶,用于催化富马酸和氨生成惶冬氨酸¨,在食品、医药、化工领域有重要用途,市场需求巨大@醋源蟪Ω司械奶於彼崦赣蒩因编码,基因全长,编码霭被岵谢天冬氨酸酶分子量约为,由的相同亚基组成,呈典型的。对称。本文以大肠杆菌基因组D0澹肞方法扩增天冬氨酸酶基因,并将其重组于融合表达型靥逯校隓诤希刈橹柿W;蟪Ω菌表达宿主,设法通过提高基因拷贝数以及融合伴侣助溶的方式提高细胞天冬氨酸酶活性,探索酶基因工程的新方法。牧嫌敕椒材料①菌株与质粒:甤晔笛槭冶4妫诤媳泶镄蚑载体J笛槭夜菇ā②酶及主要试剂:用浮⑾拗菩阅谇酆厦腹鹤陨虾I工,厥占按炕约梁泄鹤员本┎┐蠊尽庑蛴赡暇┙’禄呶3っ该盖位点编码序列聪蛞颽基因组D0錚扩增获得序列。·各酆厦,隠,双蒸水补足体积至弘问缦拢嬖け湫,℃变性℃退火嫜由鲅罚詈℃延伸,产物经%琼脂糖凝胶电泳鉴定。.こ叹菇镉刖璛盖械膒—靥辶接,转化,用菌落ḿú⒒竦正向连接的重组子,重新抽提质粒转化甤盏急泶锸匝椋ň鶶轕治觯观分子量符合预期的阳性克隆送生物技术公司测序进一步鉴定证实。.こ叹泶锸匝用无菌牙签挑取转化木接种于培养基中张ǘ任×雊·腁嬲竦磁嘌痢V啊!!·獻盏寂嘌·离心收集菌体,电泳分析。.诤系鞍椎某醪酱炕降低诱导剂的浓度和诱导温度,如·唬妫映び盏际奔渲员泶锞氨基酸和生物资源,蛋白。经试验,工程菌细胞具有较高的天冬氨酸酶活性,融合形式的酶最适温度℃,:以大肠杆菌基围组D0澹杓埔锢┰龅玫教於彼崦富颍渲刈橛诎谌诤媳泶镄蚑载体中,重组质粒转化表达宿主大肠杆菌治霰砻鳎こ叹璉盏肌1泶锎笮繁砉鄯肿恿吭的融合酶活没有影响。关键词:天冬氨酸酶;融合蛋白;;表达中圈分类号:文献标识码:文章编号:、甤’一—甤,躄,×荓,。收稿日期:—作者简介:任慧颖,。研究方向:生物制药。ㄑ蹲髡·
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工程茵的诱导表达。工程菌在℃培养至!。诱导结束后离心收集菌体,用·玊狧缓冲液重悬后进行超声破碎涓馗次O赴破碎液在·吕胄占锨溶液与溶液等体积混合,以·的速度上样于经过胶夤琼脂糖凝胶柱中,再次平衡后,用洗液·咪唑,甇は矗慈シ翘匾煨结合蛋白;接着再用的洗脱液邢赐眩吹玫侥勘耆诤系鞍住分析纯化效果。.於彼崦富盍Σ舛天冬氨酸酶活力测定参考文献ǖ婪椒ń行。℃,每小时消耗癿·孜锏拿噶课一个酶活力单位。峁敕治基因的扩增与重组质粒构建以甤蜃镈为模板,猯和R铮琍扩增获得了全长为目的基因渲邪暾奶於彼崦窸序列,肠激酶酶切位点编码序列琍产物电泳结果如图尽产物纯化后直接与盖械膒—靥辶樱菇ㄌ於酸酶与融合的重组质粒猘刈质粒图谱如图尽重组质粒猘;ü·獻盏寂嘌取样电泳分析=峁允竟こ菌在诱导后大量表达表观分子量约为×娜诤系鞍住,融合蛋白的初步分离由于构建天冬氨酸酶融合蛋白时在和天冬氨酸酶之间设计有猼亲和纯化标签,使得融合蛋白可以利用简单高效的金属螯合层析分离。菌体超声破碎后上样至亲和层析柱,经平衡、预洗和洗脱等步骤,得到较纯的融