文档介绍：PCR法获取目的基因农学农学112112班班马晴晴马晴晴孙婷婷孙婷婷张张娜娜金漪倩金漪倩胡胡斐斐徐振鹏徐振鹏PCRPCR技术的定义及其发展历史技术的定义及其发展历史PCRPCR技术的原理技术的原理PCRPCR的反应体系和条件的反应体系和条件PCRPCR法获取目的基因法获取目的基因PCRPCR技术的未来展望技术的未来展望PCR技术多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction) PCR技术即多聚酶链式反应,又称聚合酶链式反应。是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。在生物学实验中做为基础存在,可以说是现代分子生物学研究中最重要的技术。一、一、、与适当引物杂交、再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。(Taq)引入了PCR技术。,第一台PCR仪问世。《Science》杂志比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。二、二、PCRPCR技术的原理技术的原理1. PCR1. PCR技术技术在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧核苷酸,耐热性DNA聚合酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的循环合成DNA,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍。一般样品经过30次循环,可使基因的拷贝数达到数百万。PCRPCR原理原理(1)类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于寡核苷酸引物的存在(3)重复“变性--退火--延伸”的循环,可获得大量的新DNA链,而且这种新链又可成为下次循环的模板,从而指数级地获得大量DNA产物,数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍。(2)PCR过程:由变性—复性(退火)--延伸三个基本反应步骤构成①变性:94℃左右,使双链DNA模板解离成为单链;②复性:55℃左右,引物与模板DNA单链互补配对结合;③延伸:72℃左右,“模板-引物结合物”在DNA聚合酶作用下,以dNTP为原料,以靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成新的DNA链2. PCR2. PCR技术的特点技术的特点11)速度快,灵敏度高:经过)速度快,灵敏度高:经过3030轮循环,理论上目的产物的轮循环,理论上目的产物的扩增量达扩增量达223030个拷贝(个拷贝(101099拷贝)。拷贝)。22)特异性:引物的序列及其与模板结合的特异性是决定)特异性:引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCRPCR反应结果的关键;引物设计的最大原则是最大限度地提反应结果的关键;引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性,同时尽可能减少非特异性扩增。高扩增效率和特异性,同时尽可能减少非特异性扩增。33)操作简便易行:只需要数小时就可以用电泳法检出)操作简便易行:只需要数小时就可以用电泳法检出11μμgg基因组基因组DNADNA中仅含数个拷贝的模板序列。中仅含数个拷贝的模板序列。三、三、PCRPCR的反应体系和基本步骤的反应体系和基本步骤HH22O O 3535μμLL1010××PCRPCR反应缓冲液反应缓冲液55μμLL25mmol/L MgCl25mmol/L MgCl2244μμLL44种种dNTPdNTP44μμLL上游引物(引物1)上游引物(引物1)(引物2)下游引物(引物2)((约约1ng)1ng) .1 .反应体系组成成分(总体积:反应体系组成成分(总体积:50 50 ??LL))模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物BufferBufferMgMg2+2+预变性预变性模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物BufferBufferMgMg2+2+TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶9494℃℃ 5min 5min2. 2. 基本程序基本程序PCR排管Taq Taq 酶酶模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物BufferBufferMgMg2+2+循循环环仪仪9494℃℃55 55 ℃℃72 72 ℃℃72 72 ℃℃ 5 5~~7 min7 min扩增出的目标基因