文档介绍：生物仪器分析技术
核酸含量测定
——紫外分光光度法
主讲教师:林叶副教授
实验目的
1 学****和掌握应用紫外分光光度法直接测定核酸含量与纯度的原理与技术;
2 熟悉核酸定量分析仪的基本原理与使用。
型号:GeneQuant pro
品牌:通用(GE)
产地:美国
波长校准:启动后自动进行
波长范围:230, 260, 280, 320,546,562, 595,600nm
核酸定量分析仪
——DNA/RNA计算器
用途
(1)核酸和引物样品扫描测定;
(2)可检测低至20ng 的核酸样品(用7微升超微量比色杯),显示A260/280和A260/230比值作为核酸纯度检测的指标;
(3)可采用在 595nm 的Bradford 法、546nm 的双缩脲法和562nm 的BCA 法进行蛋白检测,样品通过存贮的标准曲线进行测量,直线的线性回归结果可打印出来;
(4)OD600 细菌细胞培养测定;
(5)计算寡核苷酸分子量,理论Tm值(用于PCR退火温度)。
546nm——双缩脲法/lowry法(Folin-酚法)
双缩脲法:在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成蓝紫色复合物,颜色深浅与蛋白质浓度呈正比。
lowry法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即Folin—酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深蓝色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下,蓝色深度与蛋白的量成正比。
562nm——BCA法
在碱性条件下,蛋白质将Cu2+ 还原为Cu+ ,Cu+ 与BCA 试剂形成紫色络合物,其吸光值与蛋白浓度成正比。
595nm——考马斯亮兰法(Bradford法)
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收,其光吸收值与蛋白质含量成正比。
OD600 ——检测细菌培养液的浓度
利用细菌的吸光来测量细菌培养液的浓度,从而估计细菌的生长情况,所以通常用来指菌体细胞密度。
测量细菌培养液在600nm处的吸光值,-,表明细菌处于旺盛生长的对数生长期,OD600>3表明细菌已经饱和。
细菌的生长情况,可以通过测OD600来监测。细菌的生长比较好的时期是在OD600为1时,此时可以进行传代等研究。
比色杯