文档介绍：实验名称:重组DNA技术二、实验目的:了解掌握DNA重组技术理论基础;掌握质粒载体、外源DNA的准备、酶切、连接技术方法;掌握连接产物的转化方法及操作;掌握阳性重组体的的鉴定和筛选方法;三、实验原理:重组DNA技术重组DNA技术是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法,对各种生物的核酸(基因)进行改造和重新组合,然后导入微生物或真核细胞内,使重组基因在细胞内表达,产生出人类需要的基因产物,或者改造、创造新特性的生物类型的技术。它主要包括以下几个步骤:①目的基因的获取:主要有化学合成、PCR、基因组文库、cDNA文库构建等。cDNA文库是以mRNA为模板,利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA,再复制成双链cDN***段,与适当载体连接后转入受体菌,这些受体菌包含了所有cDNA信息,总称cDNA文库。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。基因组DNA文库是利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后,与适当载体连接后转入受体菌,这些受体菌包含了所有基因组DNA信息,因此称为基因组DNA文库。②基因载体的选择与构建:常用载体有质粒、噬菌体、病毒DNA等。分为克隆载体和表达载体。克隆载体:用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等。表达载体:用于在宿主细胞中表达外源目的基因,获得大量表达产物。选择好的载体与目的基因利用限制性内切酶切割成合适片段。③目的基因与载体的拼接:通过粘性末端连接法(同源互补粘性末端连接、非同源互补粘性末端连接)、平端连接、人工接头连接、同聚物接尾、经部分补平的不匹配末端的连接等将目的基因与载体进行连接。④重组DNA分子导入受体细胞:将连接有目的DNA的载体导入宿主细胞,主要有以下几种方法:a、转化:将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞(常用大肠杆菌),并使其获得新的表型的过程。b、转染:将外源DNA导入真核细胞的过程。c、感染:以λ噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子,在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒,才能感染适当的细胞,并在细胞内扩增。⑤重组体的筛选:可通过遗传标记如抗药性标志选择、营养缺陷型的互补筛选法及分子标记(PCR、分子杂交)等直接筛选或是根据免疫化学法、酶联免疫检测法等进行间接筛选。⑥无性繁殖转化子(含重组分子的受体细胞)⑦目的基因的表达2、质粒酶切及鉴定原理限制性内切酶是一种工具酶,其特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸序列的能力,能在这个特异性核苷酸序列内,切断DNA双链,形成一定长度的DNA序列。根据限制性内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类,II型限制性内切酶只需要二价镁离子的激活,酶在其识别序列内切割双链DNA,产生的各种DN***段具有相同的末端结构,而且大多数的II型酶可提供粘性未端,有利于片段再连接,限制性内切酶对环状质粒DNA产生的酶切片段数与切口数一致。因此,鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数,就可以推断切口的数目;从片段迁移率可判断酶切片段大小。用已知分子量的线状DNA为对照,通过电泳迁移率的比较,可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子大小。本实验采用的限制性内切酶是BamHI和HindIII。对于DNA回收,回收的目的是为了纯化提取的质粒,以用于以后的分子杂交、重组质粒的构建、序列分析等。目前常用的回收技术有:柱纯化回收法、电洗脱法、低熔点琼脂糖凝胶法、DEAE滤膜插片法等,其中柱纯化回收法、电洗脱法,经济节省,操作方便,对DNA回收效果好。本实验采用试剂盒回收(柱纯化回收法),其原理是采用凝胶裂解液融化凝胶,采用特殊的收集管收集DNA后,漂洗液洗脱杂质,最后用洗脱液洗出DNA。四、主要实验仪器:不同规格移液器、EP管、常规电泳仪、紫外灯、恒温水浴箱、常规台式离心机、恒温孵箱、CP3吸附柱、收集管、培养皿、酒精灯、玻璃涂布棒等。五、主要实验试剂::pUC18DNA、λDNA(TIANGEN,MD202)、HindIII(Thermo,ER0501)、BufferR(10X)(Thermo,BR5)、BamHI(Thermo,ER0051)、BamHI-Lsp1109IBuffer(10X)(Thermo,B57)、pUC18-mir203质粒DNA(老师提供)。:琼脂糖、GoldView、1kbDNALadder(TIANGEN,MD111)、DNA电泳loadingbuffer(6X)(TIANGEN,RT201-01),电泳缓冲液。3、凝胶DNA回收:小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(庄盟国际生物,ZP202)。:T4DNA连接酶(Thermo,EL0014)、10XT4DNA连接buffer(Fermentas,00044933)。