文档介绍：医院人感染H7N9禽流感病毒核酸检测标准操作程序 一、目的确保人感染H7N9禽流感病毒核酸检测过程标准化、规范化,降低人为不规范操作对检测结果造成的影响,保证结果的准确性和可重复性。二、适用范围医疗机构临床基因扩增检验实验室按照《关于医院开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测有关工作的通知》(卫办医政函〔2013〕383号)和《关于做好医疗机构人感染H7N9禽流感检测试剂供给保障工作的通知》(卫发明电〔2013〕29号)有关要求,使用国家疾病预防控制中心制备或商品化试剂盒开展人感染H7N9禽流感病毒核酸检测工作。三、样本采集、运送和保存尽量采集病例发病早期的呼吸道样本(上呼吸道样本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液,下呼吸道样本包括痰液、气管吸取物、肺洗液、肺组织等)。可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中,以便提高检出率。患者有下呼吸道样本时,应优先采集。根据试剂说明书对样本采集方法有关要求,制订样本采集标准操作程序(SOP),并组织样本采集人员进行培训及考核。样本的采集应当严格按照SOP进行。样本采集后,按照《人间传染病的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒的相关规定进行包装,用密封容器立即送往实验室。若气温高时,需放入冰块降温。样本抵达实验室后,应尽快进行检测,24小时内能检测的样本可置于2~8℃暂时保存,24小时内无法检测的样本则应置于≤-70℃状态保存。如无-70℃保存条件时,可于-20℃冰箱暂存。样本避免反复冻融。样本采集、处理、运输及保存不当时,可因病毒RNA降解出现假阴性结果,也可因为样本“污染”出现假阳性结果。四、PCR检测(一)样本处理样本的核酸提取应当在样本处理区进行。按所采用的商品化试剂盒说明书要求,取适量待检样本、阳性及阴性对照进行核酸提取。样本应尽可能新鲜,提取过程应严防RNA酶污染及操作不当导致的RNA降解。提取过程如涉及离心步骤,应采用低温冷冻离心机;在生物安全柜内进行加样、提取过程中,为防止RNA降解,可将试管架置于托盘内平铺的碎冰上。提取好的RNA应及时用于检测,否则应当-70℃保存。如无-70℃保存条件,可于-20℃冰箱暂存。(二)试剂准备试剂准备应当在试剂准备区进行。根据所用的试剂盒,样本可进行甲型流感病毒核酸、禽流感H7亚型或H7N9病毒核酸的检测。试剂的配制按所用商品化试剂盒说明书进行。除酶混合物外,其它试剂在使用前应当在室温充分复融,混匀并瞬时低速离心。反应液分装时尽量避免产生气泡,上机前注意检查各反应管是否盖紧,以免管内溶液泄露污染仪器。分装有扩增反应液的反应管应当扣盖或装入密实袋内再转移至样本处理区。(三)加样加样应当在样本处理区进行。加样时应当使样品完全落入反应液中,不应有样品粘附于管壁上,加样后应尽快盖紧管盖。按试剂、仪器说明书完成加样和PCR反应管准备。(四)PCR扩增检测PCR扩增检测在扩增区进行。待检PCR管转移至扩增区,按顺序置于PCR仪上,编辑样本信息,按试剂和仪器说明书设定循环参数。(五)结果分析根据所用试剂盒说明书设置基线值(baseline)。荧光阈值(threshold)设定以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点为原则,且Ct值应大于所设置的扩增循环数(或显示为undet)。使用仪器配套软件自动分析结果。(六)质量控制检测过程对可能出现的假阳性和假阴性进行质量控制,除了检测商品试剂盒所提供阳性和阴性对照外,每次临床样本检测时,至少应当有1份弱阳性和3份阴性质控样本(多份阴性质控样本设置对实验室“污染”所致假阳性的监控更为有效),随机放在所检测标本的中间。弱阳性质控样本可为检测阳性的灭活稀释后保存的临床样本、灭活病毒或假病毒颗粒等,如所采用的商品化试剂盒有“内标”控制假阴性,或弱阳性质控样本来源困难,可暂不设弱阳性质控。阴性质控样本采用标本采集管内溶液即可。质控样本应与临床标本同等对待,参与样本核酸提取和扩增检测全过程。试剂盒中的阳性和阴性对照用于判断实验室的有效性,按试剂盒说明书进行。(七)实验结果的判定与解释。按照试剂盒说明书进行。对于出现弱阳性结果的样本应进行重复检测,并注意与可能的实验室轻度或样本交叉“污染”所致假阳性结果区别。五、检测结果报告按照试剂盒说明书进行。六、其它注意事项(一)人感染H7N9禽流感病毒实验室活动、样本采集和运输按照《人间传染的病原微生物名录》中高致病性禽流感病毒进行管理。从事人感染禽流感检测的技术人员必须经过生物安全培训并具备相应的实验技能,在检测过程中必须采取生物安全防护措施(使用眼罩、N95型口罩等)。样本核酸提取必须在Ⅱ级生物安全实验室,经过年检合格的二级生物安全柜内进行。实验室应具有良好的通风。(二)注意仪器设备的日常和定期维护,加样器、扩增仪和温育设备应进行定期校准。试剂盒及一次性使用的无