文档介绍：HRM建议标准优化流程 LC480***化处理亚硫酸钠处理强度受很多因素影响,且伴随DN***段化,因此对样品量操作时间等诸多操作细节有严格限制建议采用商品化试剂盒进行***化处理与后续纯化例如Qiagen的kit提供DNA保护缓冲液,显著降低了对样品量与操作时间的苛刻限制样品处理后建议再测一次OD值,HRM的样品浓度值不宜太低HRM的PCR扩增 基本要求要求Hotstart,最好5min以上 HRM往往是大批量样品,PCR加样时间较长 Hotstart可以避免长时间加样导致的非特异性PCR扩增问题饱和荧光染料,最好耐受光淬灭快速PCR试剂不适合HRM的PCR要求 taq酶的PCR扩增性能和保真性能很难同时保证 HRM本质是检测突变,因此要尽量避免在PCR扩增过程中引入突变LC480HRMMasterMix 20/10/5ul反应体系 灵敏度15%20/10ul杂合5ul杂合LC480HRMMasterMix10ul或20ul体系都可以, 10ul体系注意该处调为10TouchdownPCR/触底PCR突变或***化检测很难设计理想的引物免于实验条件的摸索优化避免引物二聚体与非特异性扩增的出现设计引物预期Tm+3度作为起始退火温度,,直至53度TouchdownPCR/触底PCR 循环数增加到50~55cycles (触底PCR及低引物浓度共同决定)TouchdownPCR/触底PCR 工作原理高退火温度时,PCR扩增的特异性好,但效率低低退火温度时,PCR扩增的效率高,但特异性低前面几个循环先保证PCR扩增特异性,优先合成较多特异性PCR产物后面的循环由于特异性模板增多,降低退火温度也有较好特异性后面几十循环低退火温度,确保高扩增效果低引物浓度 ,~,避免引物二聚体与非特异性扩增对Mg++浓度等因素的抗干扰能力更强PCR扩增需要更多循环数,建议50~55cycles