文档介绍：组织培养的方法和步骤II期:2010年4月1||来源:耳联网作者:植物组培网点击:3033要根据培养H的适当选取材料,选择原则:易于诱导、带菌少。要选取植物组织内部无菌的材料。这一方面要从健壮的植株上取材料,不要取有伤口的或有病虫的材料。另一方面要在睛天,最好是屮午或下午取材料,决不要在南天、阴天或靂水未干时取材料。因为健壮的植株和睛天光合呼吸吒盛的组织,有自身消毒作用,这种组织一般是无菌的。培养材料的消毒从外界或室内选取的植物材料,都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带人培养基,便会造成培养基污染。因此,植物材料必须经严格的表面灭菌处理,再经无菌操作手续接到培养基上。第一步,将采來的植物材料除去不用的部分,将需要的部分仔细洗干挣,如用适半的刷了-等刷洗。把材料切割成适当大小,即灭菌容器能放人为宜。置自來水龙头下流水冲洗儿分钟至数小时,冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料,可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严亜时特别有用。洗时可加入洗衣粉清洗,然后再用自來水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附看在植物表面的污物,除去脂质性的物质,便于灭菌液的直接接触。当然,最理想的清洗物质是表面活性物质一吐温。第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超挣台或接种箱内完成,准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒持浸10〜30s。山于酒持具有使植物材料表面被浸湿的作用,加Z70%酒精穿透力强,也很易杀伤植物细胞,所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料,如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗,多层鳞片的休眠芽等等,以及主要取用内部的材料,则可只用70%酒粘处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下,待酒耕蒸发后再剥除外层,取用内部材料。第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多,可根据情况选取1-2种使用见表。第四步是用无菌水涮洗,涮洗要毎次3min左右,视采用的消毒液种类,涮洗3・10次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用注意:①酒蒂渗透性强,幼嫩材料易在酒精屮失绿,所以浸泡时间要短,防止酒辅杀死植物细胞。②老熟材料,特别是种子等可以在酒擀屮浸泡时间长一些,如种}可以浸泡5分钟。③升浜的渗透力弱,一般浸泡10分钟左右,对植物材料的杀伤力不大。④漂口粉容易导致植物材料失绿,所以对于幼嫩材料要慎用。⑤—%的吐温20或80(—种湿润剂),可以降低植物材料表面的张力,达到更好的消毒效果。灭菌剂使用浓度(%)持续时间(min)去除的难易效果次氯酸钙9-105-30易很好次氯酸钠25-~15-8较难最好抗菌素4~50mg/L30~60中较好制备外植体将已消毒的材料,用无菌刀、剪、银等,在无菌的环境下,剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等,叶片则不需剥皮。在操作屮严禁用手触动材料。接种和培养(一)接种在无菌坏境下,将切好的外植体立即接在培养基上,每瓶接种1一2个,以防止交叉污染。(二)封口接种后,瓶、管用无菌药棉或盖封口,培养皿用无菌胶带封口。(三)温度培养基大多应保持在25C左右,但要冈花卉种类及材料部位的不同而区别对待。增殖外植体的增殖是组培的关键阶段,在新梢等形成后为了扩大繁殖系数,需要继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基屮,增殖培养基一般在分化培养基上加以改良,以利于增殖率的提高。增殖1个月左右后,可视情况进行再增殖。根的诱导继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根,必须转到纶根培养基上进行纶根培养。1个月后即可获得键壮根系。组培苗的炼苗移栽试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境,必须进行炼苗。一般移植前,先将培养容器打开,于室内自然光照下放3天,然后取出小茁,用自来水把根系上的营养基冲洗干挣,再栽入已准备好的基质屮,基质使用前最好消毒。移栽前要适当遮硏,加强水分管理,保持较高的空气湿度(相对湿度98%左右),但基质不宜过湿,以防烂苗。组织培养中的清洗、消毒灭菌技术III期:2010年4月1||來源:互联网作者:植物组培网点击:21901、清洗植物组织培养用的各种玻璃器川L,特别是培养瓶和盛培养基的器川L,一定要严格清洗,以防油污、匝金属离子、酸、碱等有害物质残留在瓶内,影响培养物的生长。使用过的玻璃器川L应及时清洗,先将污物如培养基、培养物倒掉,再浸入水中,然后洗涤。玻璃器111!■的洗涤,可根据器I1II■的污染程度和性质,采用不同的方法,通常有碱洗法和酸洗法。凡有微生物污染的器川1.,必须先进行高压消毒和煮沸,以杀死菌体,否则会产生砲子飞扬,污染环境,给组织培养带來严匝困难。器皿洗净后,应烘干或晾干,放在规定的地方,便于取用。常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类,即:物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处