文档介绍：:..利用不同的方法筛选和鉴定转化子摘要:通过使用不同的方法,从大肠杆菌屮筛选和鉴定出转入了GFP基因并表达出GFP的菌株。实验先用蓝白斑筛选得到含有载体的转化子,之后用菌落PCR对其中的重组子进行进一步鉴定,最终通过对表达的产物的检测确证是否能表达出GFPo实验结果表明挑选岀来的菌株并没有表达出GFP,需要挑选其他菌落继续实验。关键词:蓝白斑筛选、菌落PCR、GFP、蛋H质检测前言我们采用的是忖前应用最广泛、技术最成熟、同时也是最经典的微生物基因重组,作为载体的质粒,我们需要选择或者构建带有多克隆位点和带有抗性基因的质粒,前者有利于基因顺利导入到受体细胞,示者方便我们对转化产物进行筛选;对于受体细胞,我们所选择使用的大肠杆菌,具有遗传背景清楚,结构简单,表达效率高,容易获取等优点,已经建立起一套完善成熟的表达系统,是H前转基因领域最受欢迎、使用最普遍的系统GFPti从发现以来,已经获得了广泛充足的应用,是生物领域的重要材料绿。绿色荧光蛋白木身无毒,且不需要其他辅酶或者反应底物,在紫外或者蓝光激发下就可以自主发光,而且有较好的稳定性,当其基因与其他蛋白质表达基因相融合时,该蛋白质既能保持原有活性,发光能力也不受影响,这意味肴我们可以将GFP与我们想要了解的蛋H质相接合在一起,将GFP作为荧光标签,对蛋白质的位置、运动、活性以及相互作用等机理进行追踪和观察,因为这种特性,绿色荧光蛋白具有其他报告蛋白无法比拟的优点,已经在生物研究屮获得广泛的应用。我们已经通过一系列的实验操作,获取GFP基因,川PCR技术将其扩增并连接到载体质粒pMD19-TVector±,j|JCaCI2法将其转入到大肠杆菌小,经过木次实验的筛选和鉴定,构成了完整的转基因操作流程,将我们的课堂学习和实际操作结合起来,从而对转基因技术有一个最育接的认识。尽管在当下屮国,转基因技术备受争议,但是每一名生物专业的学生,都应学习了解国际科学社会在转基因领域上所取得的巨大成就,并看到其广泛的应用前景和巨大的市场潜力,同时将所学习到的关于转基因知识科普出去,让每一个公民都能科学、正确地认识转基因,理性、客观地参与到关于转基因的有益讨论屮去,推进我国生物科学技术的发展。一、材料、:(R・,M-,Amp-或者含pMD19-TVector)(Amp,100mg/L)的LB固体培养基、LB液体培养基、X-gal(200mg/ml)储存液、IPTG储存液(20mg/ml)、10XPCRbuffer、rTaq酶、dNTPmixtures(dATP,dTTP,dGTP,dCTP)、无菌蒸憎水、%琼脂糖凝胶、矿物油、DNAmaker、1X10LoadingBuffer引物溶液(Pl、P2各10gM)P1:GFP-F:5,-TAGTCGACTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3,(Tm=°C)(SalI)P2:GFP-R:5,-ATG-3*(Tm=°C)(Xbal)、涂布器、无菌牙签、PCR管、移液枪、移液管、离心机、PCR仪、天秤;灭菌锅;琼脂凝胶电泳系统;紫外照射摄像系统;恒温振荡培养箱