文档介绍：同组者张少华仪器编号105细胞原代培养姓名张行润系年级2009级牛科4班学号200900140177科H细胞牛物学实验 题H小鼠脾细胞培养实验一、 实验目的了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。学****细胞计数、营养液的配制等,初步掌握无菌操作方法。二、实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官,经体外培养后,直到第一次传代为止。这种培养,首先用无菌操作的方法,从动物体内取出所需的组织(或器官),经消化,分解成单个游离细胞,在人工培养下,使其不断的牛长及繁殖。细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期牛长,必须满足两个基本要求:一•是供给细胞存活所必须的条件,如适量的水、无机盐、氨基酸、维牛素、葡萄糖及其有关的牛长因子、氧气、适宜的温度,注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。(二)细胞死活鉴定死活细胞的鉴定方法有很多种,常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法,简便,易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各口不同具体的反应机理,但无论采用何种办法,都是利用了死活细胞在牛理机能和性质上的差异。染色法分化学染色法和荧光染色法,根据染色机理的不同,染料或使死细胞着色,或使活细胞着色。死活细胞在牛理机能和性质上的差异主要包括:死活细胞细胞膜通透性的差异:活细胞的细胞膜是一种选择性膜,对细胞起保护和屏障作用,只允许物质选择性的通过;而细胞死亡之后,细胞膜受损,通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这性质。台盼蓝,又称锥蓝,是种阴离了型染料,不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色,而活细胞不被着色。***蓝有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。死活细胞在代谢上的差异:是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料,氧化型为蓝色,还原型为无色。由于活细胞屮新陈代谢的作用,使细胞内具有较强的还原能力,能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型,因此美蓝染色后活的酵母细胞无色;而死细胞或代谢缓慢的老细胞,则因它们的无还原能力或还原能力极弱,使美蓝处于氧化态,从而被染成蓝色或淡蓝色。除此z外,还有一•些细胞器的专有染料。如液泡系的专有染料屮性红。屮性红是一种低毒性染料,可以使活细胞液泡着红色,而细胞质和细胞核不被着色;死细胞的液泡不被着色或浅染,染料弥散于整个细胞小,细胞核和细胞质被染成红色。有时侯为了增加染色效果可以将两种染料结合使用,如***蓝-屮性红混合染色法。三、实验器材剪子,棉球,75%酒精,移液枪,无菌操作台,正置光学显微镜,倒置光学显微镜,解剖盘,滴管,离心管,离心机,注射器,Eppendorf管,培养皿,洒精灯,槊料培养皿,载玻片,盖玻片,血细胞计数板等。US实验材料小鼠1只,细胞培养液(含牛长因子),TrypenBlue染液,PBS缓冲液,五、实验步骤(―)细胞的原代培养取材:取小鼠一只,采用断头法处死。清水洗小鼠浸入75%酒精屮消毒3min,取出转入超净工作台内的解剖盘屮,无菌操作打开腹腔,取出其脾脏,除去其周围的脂肪组织,并用PBS液H上而下淋洗1-2次,转入无菌培养皿屮待用。分离脾细胞:用滴管向培养皿屮注入30滴PBS缓冲液,再用’L/,注射时沿长轴注射。然后再用针头在脾脏上扎眼,