文档介绍：大工生化实验报告小牛肠碱性磷酸酶的提取及酶活测定、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量、SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量摘要本实验从新鲜且冷冻保存的小牛肠出发,通过刮取、离心分离、析出、提纯等方式提取小牛肠中碱性磷酸酶,利用紫外分光光度法测定该酶的活性,并利用考马斯亮蓝法测定所提取的蛋白质含量,最后通过SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳对比marker谱带近似得出蛋白样品中蛋白质的相对分子量。关键词碱性磷酸酶;分离纯化;酶活;紫外分光光度法;考马斯亮蓝;蛋白质;聚丙烯酰***凝胶;蛋白质分子量。前言碱性磷酸酶能催化核酸分子脱掉5’-磷酸基团,从而使DNA或RN***段的5’-P末端转换成5’-OH末端。主要应用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查。本实验以小牛肠为原料,分离纯化小牛肠碱性磷酸酶并研究酶活。小牛肠碱性磷酸酶的分子量为145000,等电点为碱性磷酸酶作用于缓冲液中的对硝基苯磷酸二钠,使之水解释放出对硝基苯酚,后者在405nm光波长下有最大吸收。通过测定吸光值的变化率,可测定酚的生成量,从而计算出酶的活性单位。应用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量,该反应非常灵敏,可测微克级蛋白质含量,是一种常用的蛋白质快速微量测定法。考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中的游离状态呈红褐色,当它与蛋白质结合后变为蓝色,前者最大吸收波长为465nm,后者为595nm。在一定蛋白浓度范围内,蛋白质-色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量分析。应用SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳法测定蛋白酶分子质量,根据标准样品在电泳中所做出的标准曲线,推算出被测蛋白样品分子量的近似值。1实验部分试剂与仪器试剂正丁醇、***;1mol/L醋酸,1mol/LNaOH,硫酸铵;平衡缓冲液:mol/LTris-HCl,pH=;底物缓冲液:1mol/L二乙醇***-盐酸缓冲液,pH=;酶的底物溶液:用底物缓冲液配制15×10mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液;30%丙烯酰***置棕色瓶;分离胶缓冲液:mol/LTris-HCl缓冲液,pH=,已加入10%SDS;浓缩胶缓冲液:mol/LTris-HCl缓冲液,pH=,已加入10%SDS;-310%过硫酸铵;TEMED;上样缓冲液:称100mgSDS、2mg溴酚蓝、2g甘油,加mL巯基乙醇、2mL/LpHTris-HCl,加超纯水定容至10mL;染色液:配置含%考马斯亮蓝R250,40%甲醇和10%冰醋酸的染色液500mL,过滤后备用;脱色液:500mL10%甲醇和10%冰醋酸的脱色液1000mL;电泳缓冲液。仪器匀浆机、冷冻离心机、恒温水浴、紫外可见分光光度计、离心管、剪刀、载玻片、不锈钢盘、搪瓷盘、滤布、漏斗、分液漏斗、量筒、烧杯、移液枪、比色皿、电泳仪、电泳槽、制胶板、揺床。实验过程小牛肠碱性磷酸酶的提取1)取新鲜小牛肠,用剪刀纵向剖开,用载玻片刮取小肠内粘膜,放到盘子一角。2)将小肠粘膜液集中倒入匀浆机中,加倍体积冰冷蒸馏水,高速匀浆,重复20次。3)缓慢加入一倍体积冰冷正丁醇高速匀浆15s,重复20次。取60mL匀浆液放入离心管中,另一离心管用水配平,在4℃、10000rpm条件下离心15min。4)用滤布过滤去除杂质,倒入分液漏斗中,静止分层,取下层水相,用1mol/LHAc溶液调pH到。4℃、10000rpm条件下,离心10min。5)得到上清液放入离心管中,用NaOH溶液调pH至,称取硫酸铵加到离心管中溶解;再加冰冷***,混匀,4℃静置30min以上。4℃,10000rpm,离心10min。6)上清液中,加入冰冷***,4℃放置30min以上。4℃,10000rpm,离心10min。7)取沉淀溶于平衡缓冲液至全部溶解至冰箱保存待用。8)底物处理:底物37℃水浴5min。小牛肠碱性磷酸活的检测1)将酶稀释10倍。2)紫外分光光度计检测条件为405nm波长,测定时间60s,取值2s,记录范围。3)取2个2mL比色皿,加入上述加热的底物缓冲液,校对归零。4)将稀释10倍的酶液20μL加到其中1个比色皿中,用手堵住皿口。快速上下倒2次,放回分光光度计中,测定酶动力学曲线考马斯亮蓝法测定蛋白质含量1)玻璃试管中加入5ml考马斯亮蓝。2)在mL离心管中,取酶液稀释10倍。3)取100μL加入到5mL考马斯亮蓝试管中,混匀,反应5min以上。4)紫外分光光度计检测条件:595nm波长。5)取2个比色皿,加入考马斯亮蓝,分光光度计中校对归零。6)将样品放入外侧比色皿中,读吸光值。7)根据蛋白浓度标准曲线,计算酶蛋白浓度。聚丙烯酰***凝胶制备1)装板:将垂直板型电泳的玻璃片洗净、晾干;放好胶条,用夹子夹好玻璃板,上面插上梳子,垂直放置在水平台面上备用。2)制备分离胶:在小烧杯中按下表配制所需浓度的