文档介绍：氨基酸的分离与鉴定纸色谱法化学与生物工程学院生物工程系生物化学实验报告课程名称:生物化学实验项目:氨基酸的分离鉴定—纸层析法实验室名:生物化学实验室实验时间:2012-11-15任课老师:杨艳专业班级:生物工程1142学生姓名:髙晔学号:201121030219组别:第五组实验内容【实验目的】通过氨基酸的分离,学****纸层析法的基本原理,掌握氨基酸纸层析的操作方法。【实验原理】纸层析法(paperchromatography)通常用于蛋白质的氨基酸成分的定性和定量。1944年A(J(P(马丁第一次用纸层析分析氨基酸,得到很好的分离效果。到现在为止,纸层析法已经成为定性或定量测定多肽,核酸碱基,糖,有机酸,维生素,抗生素等物质的一种最简单易行的分离分析工具。层析用于分析简单的混合物时可做单向层析。对于复杂的混合物,可做双向层析。其原理是以滤纸为惰性支持物的分配层析,层析溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性,吸附一层水作为固定相,有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时,由于分配系数不同,结果物质在两相间不断分配而得到分离。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中,点样在滤纸的一端;再选用适当的溶剂系统,从点样的一端通过毛细现象向另一端展开,展开完毕,取出滤纸晾干或烘干,再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经展开后某一物质在纸层析谱上的位置常用比移值(rateoffolw,R)来表示。R=原点至层析斑点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离ff=X/Y在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与被测物的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用单向纸层析法分离氨基酸。【实验器材】1器材层析缸、毛细管、小烧杯、量筒、培养皿、分液漏斗、层析滤纸(新华一号)、喷雾器(或白瓷盘),烘箱(或吹风机)、铅笔、直尺2试剂1)、扩展剂40mL将20mL水饱和的正丁醇和5mL醋酸以体积比4:1在分液漏斗中进行混合。然后与15mL蒸馏水混合,充分振荡,静置后分层,放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡溶剂,其余的倒人培养皿中备用。2)、氨基酸溶液0(5,的赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组份浓度均为0(5,)各配置5mL。3)、显色剂50,100mL0(1,水合茚三***正丁醇溶液。【实验步骤】(1)检查培养皿是否干燥、洁净;若否,将其洗净并置于干燥箱内120?烘干。(2)平衡:剪一大块塑料薄膜铺在桌面上,将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上,再把盛有约5mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中,用塑料薄膜密封起来,平衡20min。(3)规划:带上手套,取宽约10cm、高约15cm的层析滤纸一张。在纸的下端距边缘2,3cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A,在直线上做4个记号,记号之间间隔2cm,这就是原点的位置。另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B,在B线上以A、B两线的交点为原点标明刻度(以厘米为单位),参见下图。图2实验装置示意图(4)点样:用毛细管分别取10mL左右的氨基酸样品点在四个位置上。干后重复点样,同一位置上需点2,3次,2,3mL/次,保证每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。其中3个是已知样,1个是待测样品。(5)层析:用针、线将滤纸缝成筒状,纸的两侧边缘不能接触且要保持