文档介绍：第十四章病毒和病毒成份的提纯一、病毒的提纯(一)沉淀法(二)层析法(三)两相溶剂间分配系数法(四)红细胞吸附法 (五)电泳法(六)超速离心法(七)超滤法二、病毒蛋白亚单位的分离三、病毒脂质的抽提四、病毒糖类的抽提 一、病毒的提纯所谓病毒提纯,就是应用各种物理、化学方法,以不使病毒受损伤和失活为前提,去除宿主细胞组分等非病毒杂质,提取出高纯度浓缩的病毒样品。病毒提纯是病毒学研究的重要前提,病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质——DNA或RNA的详细研究都需要高纯度的病毒样品。病毒纯度只是一个相正确概念,很难有绝正确标准,一般以下几点能够作为判定标准。,是证明其纯度的常见方法,包括电镜检查、病毒粒子沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。,也是一种一般采用的纯度测定方法。病毒滴度对蛋白含量的比例越高,说明病毒的纯度越高。,则说明病毒材料比较纯净。,经常能够形成结晶,但少数混有杂质的病毒样品亦可形成结晶,因此这也只是一个相对标准。病毒提纯的主要依据和条件有:(1)病毒只在活的细胞内寄生、复制和增殖,要在病毒不失活的前提下,使之从细胞中释放出来,去除细胞成份。有些病毒如痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、披膜病毒,病毒粒子被释放到细胞外,能够从培养液或尿囊液中提纯;而另一些病毒如腺病毒、乳多空病毒、小DNA病毒,在毒粒成熟后只有少数病毒释放到细胞外,大量提纯时必须首先裂解细胞,使病毒大量释放。实验室常见冻融、研磨、高速捣碎、超声波处理或高压冲击、中性去污剂裂解、蛋白酶解等物理和化学的方法。经过这些方法处理获得的粗制的病毒悬液,其中常含有大量的细胞碎片,一个有效的方法是以~6000r/min离心30~40分钟,可除去90%以上的细胞碎片和杂质。(2)病毒粒子实际上是大的蛋白颗粒,能够应用提纯蛋白质的一些技术方法。(3)对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子,能够采用分级分离的技术。当然不同的病毒,其生长特性及理化学性质不同,因此提纯方法也不尽一致。(一)沉淀法主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒,有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀,且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵,能够很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。(PEG)为水溶性非离子型聚合物,具有各种不同的分子量,用于病毒沉的主要是分子量为~6000的PEG。将PEG配成50%左右的溶液,或直接将固体PEG加于毒悬液中,使其达到所需浓度,一般在4℃搅拌过夜,然后离心使病毒沉淀。Tanncock(1985年)成功地用PEG浓缩了禽脑脊髓炎病毒。、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒,但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用,故不适于这类病毒的浓缩提纯。,所携带的正电荷与负电荷相互中和,因而失去相互排斥的作用而发生沉淀。~,因此在pH3~6范围内均可沉淀,由于一部分细胞成份在等电点时亦发生沉淀,此法效果不太理想,但从感染的组织培养液中浓缩病毒,能够获得较好结果。应用酸性范围的等电点沉淀或分级沉淀病毒时,必须注意pH对病毒活性的影响及病毒粒子电荷与组织蛋白电荷的差异。(1989年)应用皂土在酸性条件下(pH4~)吸附轮状病毒SA-11,再在碱性条件下(),又使其洗脱下来,从而达到纯化目的。,具有携带其它蛋白质共沉淀的作用,能和直径大于50nm的病毒共同沉淀而不影响病毒的感染力。当向这种沉淀物加入1mol/LNaCl时,病毒又重新释放到悬液中,而鱼精蛋白依然沉淀。直径小于50nm的小型病毒则不与鱼精蛋白共同沉淀。因此,可利用鱼精蛋白去除病毒材料中直径大于50nm的异种蛋白质。(二)层析法病毒粒子表面携带特定的电荷群,因此病毒对离子交换树脂及类似的其它吸附剂具有亲和性。利用吸附剂的层析法分为两种,一种是正吸附法,即依据病毒粒子表面所携带的电荷进行特异性吸附,然后用适当浓度的离子溶液将病毒粒子解离回收;另一种是负吸附法,即只吸附组织或宿主细胞成份等非病毒蛋白,而让病毒粒子经过。收集滤液后经差速离心沉淀法回收病毒。由于各种病毒的大小和表面结构等理化性质不同,因此对吸附剂的亲和性也有显著的差异。