文档介绍：SOOCHOW UNIVERSITY
硕士学位论文
论文题目 TGF-β RⅡ靶向并激活 NK-92 细胞的
肿瘤免疫治疗作用
研究生姓名王仲娟
指导教师姓名刘海燕
专业名称免疫学
研究方向肿瘤免疫
论文提交日期 2013 年 4 月
TGF-βRⅡ靶向并激活 NK-92 细胞的肿瘤免疫治疗作用中文摘要
中文摘要
目的:
很多肿瘤可以通过分泌 TGF-β抑制 NK 及 T 淋巴细胞的功能,促进肿瘤的发
生与发展。NK 细胞有激活和抑制型两种受体,NK 细胞是否有杀伤功能取决于它
所接受的激活型信号和抑制型信号的强弱。NKG2D 是 NK 细胞的激活型受体,其
信号可以介导 NK 细胞的杀伤功能。因此我们首先克隆了 TGF-βRⅡ的胞外段和跨
膜区以及 NKG2D 的胞内段(TN)基因,用重叠延伸拼接 PCR(SOE-PCR)的方
法将两段基因拼接起来。并采用了慢病毒感染的方法制备了携带 TN 的 NK-92 稳
转细胞系。表面 TGF-βRⅡ的表达可以将 NK 细胞靶向到高表达 TGF-β的肿瘤微环
境,与 TGF-β的结合可以激活 NKG2D 的活化信号,即激活 NK 细胞的杀伤功能;
与微环境中 TGF-β的结合还能够降低其对其它细胞的抑制及对调节性 T 细胞的诱
导。我们通过体外和体内实验研究了携带 TN 的 NK-92 细胞的肿瘤免疫治疗作用。
方法:
(1) 采用 RT-PCR 和重叠延伸 PCR 获得 TN 基因,构建含有重组 TN 基因的
慢病毒穿梭质粒,并与其它包装质粒一起通过磷酸钙转染 293T 细胞,得到假病毒,
用于感染 NK-92 细胞,获得携带 TN 基因的 NK-92 细胞系。
(2) 通过 Elisa 方法检测肿瘤细胞分泌 TGF-β1 的分泌,获得高表达 TGF-β1
用于肿瘤杀伤和动物模型的肿瘤细胞系
(3) 通过 Transwell 实验,Cell Counting Kit- 8 (CCK8)表达检测 NK-92-TN
细胞的迁移及存活能力。
(4) 通过细胞毒实验,流式细胞术方法分析 NK-92-TN 的肿瘤细胞杀伤能力
和激活程度。
(5) 通过将脐血来源的 CD4+T 细胞在 TGF-β1 诱导下与 NK-92-TN 细胞共培
养,检测其对调节性 T 细胞分化的影响。
(6) 采用肝癌 SMMC7721 细胞移植肿瘤裸鼠模型,研究 NK-92-TN 细胞的
肿瘤免疫治疗作用。
I
中文摘要 TGF-βRⅡ靶向并激活 NK-92 细胞的肿瘤免疫治疗作用
结果:
(1) 成功克隆了 TGF-βRⅡ的胞外段和跨膜区以及 NKG2D 的胞内段(TN)
这一段融合基因,获得了慢病毒重组穿梭质粒,并与其它包装质粒一起通过磷酸
钙法感染 293T 细胞,获得了 NK-92-TN 稳转细胞系。
(2) 检测发现 SMMC7721,HepG2 肝癌细胞可以分泌较高水平的 TGF-β1。
(3) K-8 检测和 Transwell 实验发现,NK-92-TN 细胞的存活和迁移
能力较对照细胞系更强。
(4) 与对照细胞系相比,NK-92-TN 细胞表面 NKG2D 的表达更高,且不受
TGF-β1 的抑制。同时较对照细胞其 IFN-γ分泌水平较高。
(5) 与对照细胞系相比,NK-92-TN 细胞的肿瘤杀伤作用更强,而且在
TGF-β1 的刺激下,NK-92-TN 细胞的杀伤作用提高,表明 TGF-β1 对 NK-92-TN 细
胞具有活化作用。
(6) 与对照组相比,NK-92-TN 细胞能够抑制调节性 T 细胞的分化,且具
有剂量依赖性。
(7) 体内实验初步证明了 NK-92-TN 细胞联合低剂量放疗能够有效地抑制
肝癌细胞的生长。
结论:
本研究所构建的 NK-92-TN 细胞系较对照细胞呈活化状态,并且在 TGF-β1 的
作用下,其活化、迁移及杀伤活性不仅没有受到抑制,反而被进一步激活。体内
实验也初步证明了 NK-92-TN 细胞治疗能够有效地抑制肝癌的生长。
关键词: NK-92-TN,TGF-β1,细胞毒,肿瘤免疫治疗,调节性 T 细胞
作者: 王仲娟
指导老师: 刘海燕
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TGF-βRⅡ靶向并激活 NK-92 细胞的肿瘤免疫治疗作用英文摘要
Tumor immunotherapy using NK-92 cells carrying
TGF-β receptorⅡand NKG2D
Abstract
Obj