文档介绍：实验二:分光光度计的学习之考马斯亮蓝G-250法(Bradford法)测定蛋白质含量定一实验目的学习分光光度计的基本原理和使用方法,并使用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量。二实验原理考马斯亮蓝G-250(CoomassiebrilliantblueG-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,灵敏度比Lowry法还高4倍,可测定微克级蛋白质含量,测定蛋白质浓度范围为0~1000μg/mL,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。三实验材料实验材料:未知浓度的牛血清样品主要仪器:试管、移液枪、分光光度计等。试剂:蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制:称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50mL90%乙醇中,加入85%(W/V)的磷酸100mL,最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。四实验步骤标准曲线制作:取6支10mL干净的试管,按表1取样。摇匀后放置2min,用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色,记录测定的光密度OD595nm,并做标准曲线。表1低浓度标准曲线制作管号0123451mg/ml标准蛋白(ml)(ml)-250(ml)555555蛋白浓度(mg/ml):拟合标准方程:y=+,按下表取样。,,加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂,充分混合,放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色,记录光密度OD595nm,并通过标准曲线查得待测品提取液中蛋白质的含量X(μg)