文档介绍：MDCK细胞培养MEM细胞生长液配制500mlMEM液+5ml双抗(青霉素+链霉素)+5mlL■谷氨酰胺++50ml小牛血清90%MEM液1%双抗1%L・谷氨酰胺 %碳酸氢钠10%%EDTA月夷酶(从冰箱取出后放入培养箱屮待用)(1)细胞传代将细胞瓶屮的生长液倒去,加入MEM液(大概6ml左右)清洗,倒去;加入EDTA■肺酶(根据细胞消化情况而加量),倒去;再加入EDTA■胰酶,放置培养箱,进行消化(大概10分钟左右),待其细胞开始脱落后(在细胞瓶屮呈毛玻璃);吸干EDTA■胰酶倒去,放置培养箱一段时间(细胞呈逐个完整),取岀;【细胞生长好,多,可1传3或者1传4】将配好的细胞生长液吸入,吹打混匀,待完全脱落至过长液屮;将其分装入细胞瓶和细胞板屮。6ml/瓶37°C培养1ml/孔CO2培养箱(用于标本接种)(2)标本处理复融,从・70°C冰箱取出,常温下溶解;充分震荡,后取出试导,至4C冰箱屮,静置20分钟左右;取螺旋管,在其加入().2ml的双抗(20%),,放置4°C,过夜上毒。(3)细胞上毒(需培养一周)洗细胞,将细胞板(前一天)上的液体(生长液)吸干,加入1ml的MEM,清洗,重复一次,然后吸干;加入处理后的病毒液180ul;;1ml/孑L加入病毒过长液后,放置CO2培养箱,培养一周;并将上周上毒的细胞液取出,放置・70°C冰箱,隔天鉴定。配制病毒过长液:lOOmlMEM屮加入1ml双抗,1mlL■谷氨酰胺1mlTPCK-胰酶 :病毒经系列稀释,与一定浓度的红细胞混合,混合液放置在专为血凝试验设计的板的圆底屮,未出现凝集的红细胞可在孔底自由滚动,形成浓密的,极易识别的细胞团,而凝集红细胞不能在池底自由滚动,均匀地覆盖池底。(4)1%人O型红细胞洗涤首先应选择无乙肝病毒携带者的O型血,待其自然沉降后;吸取红细胞层的红细胞置入离心管屮;加入无菌生理盐水至离心管2/3处,两管平衡后,1800r/10min;用无菌吸管吸去生理盐水,再加入生理盐水、混匀;重新离心,重复3次,离心取出后;取细胞瓶,吸取9ml生理盐水;加入1ml的离心好的红细胞,混匀即可。(5)病毒鉴定将病毒培养(・7O°C的病毒细胞培养液)取出,常温下解冻;取鉴定板,将病毒液混匀(2孔合一孔),滴加3滴病毒液;将洗涤好的1%人O型红细胞,滴加3滴;放置lh后,观察血凝结果。凝集为阴性,扩散为阳性,阳性吸出病毒液4°C冰箱保存,隔天做效价试验。(6)病毒效价测定(血凝试验)从4C冰箱取出前天阳性标本的病毒液室温静置。将病毒培养液,进行倍比稀释:先在A孔中加入lOOul的病毒液;在取50ul生理盐水依次加入B-H孔屮;以A孔中取出50ul加入B孔中,混匀;依次加入各孔做倍比稀释,并做生理盐水对照;加入1%人O型红细胞50ul各孔,混匀静置lh后观察;以呈现完全血凝时的稀释度为该病毒的最大效价。(7)病毒血凝抑制试验(病毒种鉴定)将病毒液