文档介绍：实验11质粒DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳1实验目的掌握碱裂解法提取质粒的原理和方法,掌握琼脂糖凝胶电泳分离鉴定DNA的原理和方法。(plasmid)是在细菌中以独立于染色体之外的方式存在,是细菌染色体外的小型双链环状DNA复制子。理论上讲,所有的细菌株系都含有质粒,有些质粒携带有帮助其自身从一个细胞转入另一个细胞的信息,即F质粒,有些则表达对一种抗生素的抗性,即R质粒,还有一些携带的是参与或控制一些不同寻常的代谢途径的基因即降解质粒。质粒的大小不定,小的不到1kb,大的超过500kb,每个质粒都有一段DNA复制起始点的序列,它帮助质粒DNA在宿主细胞中复制。对细菌的某些代谢活动和耐药性表型具有一定的作用。目前,已发现有质粒的细菌有几百种,已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(DNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小,%~3%。根据相对分子质量的大小,大致上可以把质粒分成大小两类:较大一类的相对分子质量是40×106以上,较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质,可以把质粒分为两类:一类是严紧型质粒,当细胞染色体复制一次时,质粒也复制一次,每个细胞内只有1~2个质粒;另一类是松弛型质粒,当染色体复制停止后仍然能继续复制,每一个细胞内一般有20个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关,某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型,而在变形杆菌内则属松弛型。在基因工程中,常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体,如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr),并含有5种内切酶的单一切点。如果将DNA片段插入EcoRI切点,不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将DNA片段插入到HindIII、BamHI或SalI切点,就会使抗四环素基因失活。这时,含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素,但对四环素敏感。没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素,而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。pSC101与pBR322相似,只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点。质粒运载体的最大插入片段约为10kb(kb表示为千碱基对)。,携带外源基因进入细菌体内进行扩增或表达,一个重要前提条件是要获得批量纯化的质粒DNA分子。质粒的提取方法很多,大多包括3个主要步骤:细菌的培养、细菌的收集和裂解。在质粒DNA的分离和纯化过程中,毫无疑问,宿主细胞的裂解是分离质粒DNA实验操作的关键步骤。常用的质粒DNA分离方法有3种:碱裂解法、煮沸法和去污剂裂解法。前两种方法比较剧烈,它们可以破坏碱基配对,使宿主细胞的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA由于拓扑缠绕,两条链不会互相分离。当外界条件恢复正常时,质粒的DNA双链又迅速恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,其大小范围在1KB至200kb以上不等。所以,质粒DNA提取与纯化是最基本的分子生物学实验技术,其中,碱裂解法提取的质粒产量高、纯度好,是一种最为常用的方法。~,细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开,而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下,大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心,可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质,质粒DNA尚在上清中,收集上清即可得到富集的质粒DNA。近年来,随着基因治疗和DNA疫苗的发展,质粒逐渐成为一种新型的生物大分子医药产品,药用质粒的大规模制备成为生物下游过程的重要研究课题。采用此碱裂解法制备高拷贝数质粒(如pUC系列)时,质粒DNA的产量通常约为3~5μg/ml菌液。随着生化技术的发展,市场上出现了商品化的试剂盒用于提取及纯化质粒,有些试剂盒采用了传统的SDS碱裂解法,结合DNA制备膜技术,具有高效、快速、方便之特点。还有些试剂盒利用层析的原理纯化质粒DNA,DNA分子中磷酸二酯链骨架在高盐作用下脱水,使得暴露的磷酸基团吸附硅胶,经水溶性缓冲液重新水化后,DNA能从层析柱上回收。大多数试剂盒分离纯化的原理为先使经过分离的质粒DNA吸附在柱或膜上,然后常规用乙醇洗涤,最后用水将吸附在柱上或膜上的DN