文档介绍：工学博士学位论文
(同等学力人员)
抗虫 Bt 基因 cry1Ac 甜菜叶绿体遗传
转化与表达研究
崔杰
哈尔滨工业大学
2008年10月
国内图书分类号:Q812
国际图书分类号: 575
工学博士学位论文
(同等学力人员)
抗虫 Bt 基因 cry1Ac 甜菜叶绿体遗传
转化与表达研究
博士研究生:崔杰
导师:杨谦教授
申请学位:工学博士
学科、专业:环境科学与工程
所在单位:哈尔滨工业大学食品科学与工程学院
答辩日期:2008 年 10 月
授予学位单位:哈尔滨工业大学
Classified Index: Q812
: 575
Dissertation for the Doctoral Degree in Engineering
IC TRANSFORMATION AND
EXPRESSION OF BT GENE CRY1AC IN
CHLOROPLAST OF SUGAR BEET
Candidate: Cui Jie
Supervisor: Prof. YangQian
Academic Degree Applied for: Doctor of Engineering
Speciality: Environmental Engineering
Affiliation: School Food Science and
Engineering Harbin Institute of
Technology
Date of Defence: October,2008
Degree-Conferring-Institution : Harbin Institute of Technology
摘要
摘要
甜菜(Beta vulgaris L.)是我国重要的糖料作物,也是虫害非常严重
的作物之一,尤其是甘蓝夜蛾的危害更为严重,化学防治达不到预期效果,
还严重污染环境。随着人类生态及环保意识的加强,大力发展绿色农业已经
成为新时代的要求,因而,培育高抗虫甜菜新品种成为一项重要研究课题,
基因工程方法培育抗虫品种是害虫防治的有效途径。本论文首次尝试对未知
叶绿体基因组序列的甜菜进行抗虫基因的叶绿体转化与表达研究。以克隆
的甜菜叶绿体基因atpB/rbcL为同源片段,以作用鳞翅目的Bt基因cry1Ac为
外源目的基因,以 aadA 基因为筛选标记基因构建了甜菜叶绿体定点整合
转化载体,基因枪法转化甜菜,通过抗性筛选、分子检测及抗虫试验等,最
终获得了甜菜抗虫转基因再生植株及后代,并对转基因植株后代抗虫基因遗
传稳定性进行了研究,以及对叶绿体转化技术的机理进行了探索,最终建立
了甜菜叶绿体转化体系。
通过对甜菜不同基因型、外植体及培养基激素组合等再生影响因素的筛
选,优化了各类培养基配方,建立了以甜菜叶柄为外植体的高效不定芽直接
再生体系,为转基因再生植株的获得打下了基础。通过抗性筛选试验确定了
甜菜遗传转化中适宜的筛选剂(壮观霉素和卡那霉素)及其使用浓度
(30mg/L和50mg/L),确定了甜菜叶绿体转化的筛选标记基因为aadA基因。
通过比较试验,借鉴已有植物叶绿体 DNA 提取方法优点,并结合甜菜
特性(糖分含量较高),研究建立了甜菜叶绿体 DNA 分离纯化方法。试验
证明:利用该方法获得的甜菜叶绿体 DNA 不仅纯度高,得率提高 3 倍以
上,可直接用于分子生物学研究及基因组测序。
由于甜菜叶绿体基因组全序列未知,本研究首先利用高等植物叶绿体基
因组在进化过程中的高度保守的特性,借助生物信息学软件分析了烟草、水
稻、菠菜、玉米等高等植物的叶绿体基因组全序列资料,筛选到紧密连锁的
atpB 基因与 rbcL 基因、rps7 基因与 ndhB 基因两个位点,并参照烟草、水
稻和菠菜叶绿体基因组全序列资料中相应区段核苷酸序列,分别设计引物,
PCR 方法成功克隆了甜菜叶绿体中与光合作用有关的重要功能基因 atpB 和
rbcL 及 rps7 和 ndhB 的完整基因,测序、序列分析及同源性比较证实:得
到的结果与预期相符。其中,atpB 和 rbcL 基因序列已提交到 GenBank,登
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