文档介绍：浙江大学药学院
博士学位论文
金葡液有效成分鉴定及重组金葡菌肠毒素生物学活性研究
姓名:丁丁
申请学位级别:博士
专业:药物分析学
指导教师:陈枢青
20090901
金葡液有效成分鉴定及重组金葡菌肠毒素生物学活性研究陈枢青中文摘要浙江大学药学院:博士研究生:导师:药物分析学教授丁金葡菌肠毒素由金黄色葡萄球菌分泌产生,是一种典型的超抗原。目前已有超过种金葡菌肠毒素获得了鉴定,其中包括经典的肠毒素以及新近发现的多种金葡菌肠毒素。和普通抗原分子不同的是,金葡菌肠毒素分子可以以完整形式和肿雍蚑细胞受体分子结合。作为目前已知的最强大的赴乖克甚至皮克数量级浓度的金葡菌肠毒素分子在体内和体外均可以导致大量赴的增殖并促使其分泌产生多种细胞因子。金葡菌肠毒素的上述特征提示其可以作为一种免疫调节制剂用于人肿瘤以及相关恶性疾病的免疫治疗。目前,相关临床前研究以及临床研究均显示了利用基因工程制备的靶向性的金葡菌肠毒素分子极有望成为新型抗肿瘤制剂。在国内,由金葡菌发酵滤液制备获得的金葡素注射液作为生物反应调节剂已广泛地应用于肿瘤疾病的治疗,而相关生产企业声称其有效成分是金葡菌肠毒素。临床报道显示金葡素注射液具有明显的免疫调节作用,患者在进行放化疗过程中联合使用金葡素注射液可使得赴俊疌细胞比例以及细胞数量获得显著提高。同时,因放化疗引起的相关毒副作用如胃肠道反应、骨髓抑制等可获得明显的缓解。金葡素注射液的使用对肿瘤患者短期疗效的提高以及生存时间的延长均具有积极的意义。但另一方面,有约—%的患者在使用金葡素注射液的过程中会产生以轻度以及中度发热为主的不同程度的副反应,其中也包括在注射部位产生的红肿、疼痛等等。浙江人学博上学位论文
本研究利用了纳升液质联用技术结合一向凝胶电泳技术对不同生产企业阳协和集团有限公司,浙江省耀江药业有限公司,杭州国光药业有限公司,注:因涉及生产企业相关利益,本论文中提及的三家企业分别用企业⑵笠礏以及企业妫闹谐鱿值钠笠得圃谂帕兴承蛏嫌階、无对应关系的金葡素注射液产品中的蛋白质成分进行了鉴定。结果显示,由企业慕葡素注射液中,有超过种金葡菌属以及来源于其他种类革兰氏阳性菌的蛋白质获得了鉴定;由企业慕鹌纤刈⑸湟褐杏纸鹌暇粢约袄丛从谄渌类革兰氏阳性菌的蛋白质获得了鉴定;由企业慕鹌纤刈⑸湟褐杏纸葡菌属以及来源于其他种类革兰氏阳性菌的蛋白质获得了鉴定。本研究同时利用了椒ǘ阅称笠注:因涉及生产企业相关利益,企业名称隐去峁┑囊恢杲鹌纤刈⑸湟荷昊蜃橹泻械慕鹌暇Χ舅鼗分布进行了检测。结果显示在该生产菌株基因组中携带有七种肠毒素基因,瑂,,瑂和。我们分别克隆获得了包括上述各种肠毒素基因以及在内的多种金葡菌肠毒素基因,并进行了相关多种重组金葡菌肠毒素的表达及纯化。体外研究表明上述获得的重组金葡菌肠毒素具有典型的超抗原性质,可以显著地刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖并增强其对肿瘤细胞生长抑制的作本研究将重组金葡菌肠毒素庖連痗小鼠以及新西兰白兔,制备获得了抗∈蟮タ寺】固逡约巴枚嗫寺】固濉=蒙鲜隹固褰⒘擞糜诩觳釹的椒ú⒍愿梅椒ń辛擞呕峁允舅⒌乃ǹ固寮行腅法的线性检测范围为./,其日间精密度以及准确率分别为—.ズ..ィ淙漳诰芏纫约白既仿史直鹞.%和.%,与其他种类重组肠毒素不存在交叉反应。另一方面,金葡菌肠毒素是唯一一种具有致呕吐活性的超抗原。目前有相当数量的流行病学研究结果显示在金葡茵引起的食物中毒中,以及是最主要的几种致病因子。但是,目前对于金葡菌肠毒素在被摄入至胃肠道后的命运以及金葡菌肠毒素如何引起食物中毒症的机理状仍不甚清楚。同时,金葡菌用。浙江人学博貉宦畚中文摘要
肠毒素致呕吐活性和超抗原活性之间的关系仍然未知。=峁允局刈甋肿涌梢砸酝暾肿有问酵腹鼵单层细胞膜,且在小时以内,⑸湟河行С煞旨电泳分析以及胶内酶切将来源于三个不同企业的金葡素注射液用超滤浓缩约倍后进行电泳分析。将凝胶染色后根据条带浓度分割并切成小片。而后将胶碎片置于苤薪纳升液质联用分析将样品用上样缓冲液溶解、超声,而后进行纳升液质联用分析。利用三重四级杆线性离子阱质谱获得的质谱数据用软件针对革兰氏阳性菌数据库进行搜索。鹌纤刈⑸湟荷曛薪鹌暇Χ舅鼗蚣觳夂投嘀种刈榻鹌暇Χ舅氐闹备及其超抗原活性检测金葡菌肠毒素基因检测以及重组金葡菌肠毒素的制备利用椒ǘ阅称笠堤峁┑囊恢杲鹌纤刈⑸湟荷昊蜃橹械某Χ舅基因分布进行检测。而后将由竦玫亩嘀直嗦虢鹌暇Χ舅氐幕蚩寺≈!6罄么蟪Ω司鶥泶锎有昵┑闹刈榻鹌暇Χ舅亍@们缀筒阄龃炕蠫标签的重组金葡茵肠毒素,用凝血酶将昵┤コ罄靡趵胱硬阄龆灾刈榻鹌暇Χ舅亟写重组金葡菌肠毒素的超抗原活性检测利用ǘ越