文档介绍：IgG 的分离与提纯:硫酸铵沉淀法点击次数: 201 发表于: 2008-08-23 16:56 转载请注明来自丁香园来源: 丁香园以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物,包括血清的全部成分。但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性,不应含有非抗体的血清蛋白。因此,为了浓缩和提高抗体的效价,或为制备免疫球蛋白特异性抗体时,通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。γ球蛋白( IgG )是血清免疫球蛋白的主要成分,约占全部免疫球蛋白的 75% ,因此,抗体的分离纯化主要是分离纯化 IgG 。纯化 IgG 小量几十 ml的话,用 protein A或 protein G就可以,疏水柱等也可以纯化;大量的话,上百 ml ,可以使用 streamline protein A。之前根据载量估计一下需要的柱子体积。实验室中常用硫酸铵沉淀后过 DEAE 纤维素柱,比较简便可获较纯的抗体。下面以此方法为例介绍 IgG 的分离与提纯。一、材料与试剂配制 1、动物血清 2、硫酸铵饱和溶液硫酸铵 800g~850g H 2O1 000ml 加热至绝大部分溶质溶解为止,趁热过滤,置室温过夜,然后以 28 % NH4 OH 调 pH 至 (不调 pH 值也可以)。注:硫酸铵以质量优者为佳,因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属,可在溶液中通入 H 2S,静置过夜后滤过,加热蒸发 H 2 S即可。 3、液 A液: NaH 2 PO 4液 NaH 2 PO 4· 2H 2O 加H 2O至 B液: Na 2 HPO 4液 Na 2 HPO 4· 12H 2O 加H 2O至1 000ml 取A液 19ml ,B液 81ml 加水至 1000ml 即可。 4、 1%BaCl2 溶液 5、纳氏液 HgI KI 加 H 2O至溶化后过滤,然后再加 20% ,混合即可。 6、 Mol/L 的 HCl 液和 Mol/L 的 NaOH 液 7、洗脱液的 NaCl 液。 8、透析袋(或玻璃纸) 二、操作方法 1、取 20ml 血清,加生理盐水 20ml ,再逐滴加入( NH4 ) 2 SO 4饱和溶液 1 0ml ,使成 20% ( NH4 ) 2 SO 4溶液,边加边搅拌,充分混合后,静置 30min 。 2、 3000r/min 离心 20min ,弃去沉淀,以除去纤维蛋白。 3、在上清液中再加( NH4 ) 2 SO 4饱和溶液 30ml ,使成 50% ( NH4 ) 2 SO 4 溶液,充分混合,静置 30min 。 4、 3000r/min 离心 20min ,弃上清。 5、于沉淀中加 20ml 生理盐水,使之溶解,再加( NH4 ) 2 SO 4饱和溶液 1 0ml ,使成 33% ( NH4 ) 2 SO 4溶液,充分混合后,静置 30min 。 6、 3000r/min 离心 20min ,弃上清,以除去白蛋白。重复步骤 5, 2~3 次。 7、用 10ml 生理盐水溶解沉淀,装入透析袋。 8、透析除盐,在常水中透析过夜,再在生理盐水中于 4℃透析 24h ,中间换液数次。以 1%BaCl2 检查透析液中的 SO42- 或以纳氏试剂检查 NH4 (取 3~4ml 透析液,加试剂 1~2 滴,出现砖红色即认为有 NH4 存在),直至无 SO42- 或 NH 4出现为止。也可采用 SephadexG25 或电透析除盐。 9、离心去沉淀(去除杂蛋白),上清液即为粗提 IgG (即γ球蛋白,如以 36% 的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白, Euglobin ,含γ球蛋白)。 10 、过 DEAE -纤维素层析柱。以 ( NaC l)洗脱,收集洗脱液。也可采用 SephadexG150 或 G200 柱。 11 、蛋白质及其定量鉴定。 12 、 IgG 的纯度鉴定可采用下列方法之一鉴定。(1)区带电泳玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后,只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时,同时可用全血清样品,不同浓度( NH4 ) 2 SO 4盐析样品进行电泳,以资比较。(2)琼脂双相双扩散鉴定预先准备该 IgG 免疫异种动物所获的抗 IgG 血清。将 IgG 与抗 IgG 血清进行双相双扩散,如 IgG 提纯的话,则在两样品孔之间出现一条沉淀线。(3)免疫