文档介绍：硕士学位论文
论文题目三聚氰胺、沙丁胺醇及苯乙醇胺 A 的酶联免
疫吸附分析法(ELISA)的研究和应用
研究生姓名曹碧云
指导教师姓名邓安平(教授)
专业名称分析化学
研究方向免疫分析
论文提交日期
三聚氰胺、沙丁胺醇及苯乙醇胺 A 的酶联免疫吸附分析法(ELISA)的研究和应用摘要
摘要
三聚氰胺、瘦肉精等食品安全事件的频发,使得食品安全问题一再成为社会
关注的热点。因而,建立快速检测三聚氰胺、瘦肉精类物质的方法迫在眉睫。本
研究分别建立了测定食品中三聚氰胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺 A 的间接竞争酶联免
疫吸附分析法(ic-ELISA)。
三聚氰胺是一种重要的三嗪类含氮杂环有机化工原料,然而,由于三聚氰胺
分子中含有大量氮元素,因而一些不法分子为降低成本在小麦粉、饲料、奶粉等
植物性或动物性高蛋白类食品中添加这种非食品性化工原料,以提高其产品中的
蛋白质含量。三聚氰胺本身为低毒性,但如果与三聚氰酸并用,会形成无法溶解
的氰尿酸三聚氰胺,造成严重的肾结石。2004 年、2007 年先后爆发的宠物毒粮事
件,2008 年的三鹿奶粉事件,均是由于非法添加三聚氰胺。因而,急需建立高灵
敏度、高特异性、快速、可靠的定量/筛选三聚氰胺的分析方法。在本研究中,为
增强检测牛奶、奶粉、饲料样品中三聚氰胺酶联免疫吸附分析法(ELISA)的灵敏度
和特异性,采用了合理的半抗原修饰和异型抗体/包被抗原组合策略。采用 2-氯-4,
6-二氨基-1, 3, 5-三嗪(CAAT)和三聚氰胺作为原料,合成了三种连有不同长度的连
接臂末端带羧基的三聚氰胺衍生物,并与载体蛋白偶联制得免疫原和包被抗原。
采用杂交瘤技术成功的制备了抗三聚氰胺的单克隆抗体。在最优实验条件下,
ELISAs 法测定三聚氰胺的标准曲线线性范围为 -100 ng/mL,IC50 值在 –
ng/mL 之间。与已报道文献相比,灵敏度增强了 10-300 倍。同时 ELISAs 的交叉
反应率值也证实了该分析方法的高特异性。本实验选择了纯牛奶、奶粉、饲料等
五种样品作为加标回收实验样品,用于 ELISA 测定,回收率在 –%之间,
批内变异系数(coefficients of variation, CV)–% (n=3),批间CV -%
(n=3)。与 HPLC 实验结果相关系数为 ,相关性好。因而所建立的 ELISA 法
经证实是一种可行的定量/筛选三聚氰胺的分析方法。
β-激动剂即为俗称的瘦肉精类物质,因食用含有β-激动剂残留的畜产品而发
生的中毒事件已屡见不鲜,中华人民共和国农业部先后多次颁布公告,明令禁止
在饲料和动物饮用水中使用β-激动剂。沙丁胺醇是继克伦特罗之后最常被滥用的
I
摘要三聚氰胺、沙丁胺醇及苯乙醇胺 A 的酶联免疫吸附分析法(ELISA)的研究和应用
一种β-激动剂,所以对其性质及检测方法的研究也越来越引起人们的重视。在本
研究中,合成了三种连有不同长度连接臂的沙丁胺醇包被抗原和免疫原,成功的
制备出抗沙丁胺醇的两种多克隆抗体,建立了高灵敏度、高特异性的间接竞争
ELISAs 法,并用液相色谱串联质谱法(LC-MS-MS)证实了该法测定动物组织和饲
料样品时的可靠性。在最优实验条件下,基于两种抗体/两种包被抗原的四种组合
条件下测定沙丁胺醇得到的 ELISAs 方法的 IC50 值在 - ng/mL 之间,表明
建立的 ELISA 方法具有很高的灵敏度。同时 ELISA 的交叉反应率值也证实了该分
析方法的高特异性。选择猪肉和猪饲料样品做加标回收实验, 回收率在
–%,批内 CV 为 –% (n=3),批间 CV 为 -% (n=3),与
LC-MS-MS 实验结果相关系数为 ,相关性好。因而,该 ELISA 法经证实是
一种可行的检测沙丁胺醇的分析方法。
苯乙醇胺 A 是一种在中国非法使用的新型β-激动剂。本研究中,建立了一种
高灵敏度高特异性的检测动物组织和饲料样品中苯乙醇胺 A 的间接竞争 ELISA
法,并用液相色谱串联质谱法(LC-MS-MS)进行了方法的证实。通过还原硝基为氨
基合成苯乙醇胺 A 衍生物,采用重氮化法与载体蛋白偶联。考察了免疫的四只兔
的抗血清的灵敏度和特异性。所有的血清均表现出高灵敏度,IC50 值均低于
ng/mL。所建立的最灵敏的 ELISA 法的灵敏度 IC50 和检出限 LOD 分别为