文档介绍：摘要目的: 建立人胎儿角膜内皮细胞体外原代培养、传代培养和冻存复苏的方法,探索优化人胎儿角膜内皮细胞的体外培养体系。方法: 一、人胎儿角膜内皮细胞原代、传代培养和冻存复苏方法及衰老细胞检测 l、原代培养无菌操作获取胎儿角膜片,贴壁法(角膜片切割成周边和中央块分别贴壁)、揭膜法和消化法进行原代细胞培养,培养液用DMEM/F12+lO%胎牛血清,常规条件培养。 2、传代培养及冻存复苏-细胞生长汇合达80%时,用不同浓度的胰酶/EDTA、胶原酶一I等37"(2消化5—30 分钟不等,按1:2比例传代接种,并常规换培养液培养。用90%胎牛血清加IO%DMSO 配制成细胞冻存液将培养的角膜内皮细胞冻存。 3、13一半乳糖苷酶原位染色对出现衰老状态的P3代胎儿角膜内皮细胞,按试剂盒说明进行13一半乳糖苷酶原位细胞染色,镜下观察染色情况。二、胎儿角膜内皮细胞培养体系的优化将传代内皮细胞以合适浓度接种于96孔培养板,第二日待细胞贴后分别换人胎儿角膜基质细胞条件培养液、%、5%、10%、20%的牛角膜内皮细胞裂解液的培养液以及DMEM/F12+10%FBS。培养适当时问后,MTT法检测细胞增殖情况,多功能酶标仪读取各孑L细胞00490值。三、胎儿角膜内皮细胞的鉴定将传代培养的内皮细胞用NSE、nestin、ZO一1、Ki67、CK一3/12和vimentin抗体进行荧光染色,观察传代细胞是否保持有角膜内皮细胞的特性,以角膜基质细胞作为阴性对照。收集传代角膜内皮细胞总mRNA,检测Na+-K+-ATP酶、Z沪1在基因水平上的表达情况,以角膜基质细胞作为对照:对P3代衰老角膜内皮细胞基因水平p16、SOD2和 Ki67的表达进行定量检测,以原代角膜内皮细胞为对照。对固定的胎儿角膜进行组织切片并用HE染色观察内皮细胞的形态。四、统计学分析MTT法检测结果 SPSS ,I’法检测的结果进行组问比较的统计学分析,P<。结果: 一、胎儿角膜内皮细胞的生长情况观察 l、原代培养角膜组织块贴壁培养三天后,镜下可见内皮细胞沿组织块边缘爬出,随着培养时问延长细胞呈铺路石样向周边铺展扩增,大部细胞形态呈规则多边形、生长状态良好。 2、细胞传代、冻存复苏和衰老细胞染色 .25/"C条件下消化5-10分钟可观察到:角膜周边组织块培养的原代内皮细胞消化后大部分细胞呈单细胞状态,l:2传代培养可见细胞贴壁生长,3-5天后可见形态规则的多边形小细胞集落分布于不规则的大细胞间并有明显有扩增;但是角膜中央组织块培养细胞传代后少见有可扩增的小细胞集落较易衰老。连续传3代后的内皮细胞,贴壁和增殖能力明显减弱,细胞形态变大不规则、胞质内空泡渐增多,细胞数量渐少,B一半乳糖苷酶原位染色后见含空泡的大细胞胞质内呈蓝色着色,不含空泡的小细胞胞质未见明显着色。冻存复苏后的角膜内皮细胞能贴壁生长可见扩增,贴壁率与未冻存的细胞相近。二、统计学分析MTT法检测的结果胎儿角膜基质细胞条件培养液、%、5%、10%、20%牛角膜内皮细胞裂解液的培养液和DMEM/F12+IO%FBS培养液对胎儿角膜内皮细胞进行培养,4—5天后MTT 法测细胞增殖能力,结果经多组间方差分析显示(F= P>):DMEM/F12+IO% %、5%、10%浓度牛角膜内皮细胞裂解液的培养液比较,差异均有显著性意义,其中5%浓度组OD值最高,对角膜内皮细胞增殖的促进效果更明显。三、胎儿角膜内皮细胞的鉴定 1、细胞免疫荧光检测传代的胎儿角膜内皮细胞用NSE、nestin、Zo-l、Ki67、抗体进行了荧光染色,共焦显微镜下观察,见胞膜有抗体ZO一1阳性染色,胞质内呈现抗体NSE和nestin阳性染色;胞核有强弱不等的Ki67抗体阳性染色;抗体CK一3/12 和vimentin均无明显阳性染色。 2、细胞分子生物学检测 RT-PCR检测显示,胎儿角膜内皮细胞在基因水平上均有Na+_K+-ATP酶和Zo-1 的高表达,而角膜基质细胞几乎无表达;P3代角膜内皮细胞中p16和SOD2表达量显著升高而Ki67的表达下降,表明体外培养细胞增殖能力降低,逐渐衰老。 3、角膜切片组织化学检测对固定的角膜铺片进行HE染色,见周边部内皮细胞呈立方形紧密排列,而中央部单层内皮细胞呈扁平状紧密连接。结论: 1、组织块法是一种有效的体外培养原代人胎儿角膜内皮细胞的方法; 2、原培养皿1:2连续传代法可以将角膜内皮细胞传5代以上; 3、角膜周边部内皮细胞增殖能力强于中央部; 4、90%FBS+IO%DMSO冻存方法可以有效的保存角膜内皮细胞; 5