文档介绍：实验五:质粒实验五:质粒 DNA DNA 的双酶切的双酶切与电泳检测与电泳检测一、实验目的?通过本实验掌握质粒 DNA 双酶切的原理和操作方法二、实验原理??限制性内切酶限制性内切酶是一类能识别双链 DNA 分子特异性核酸序列的 DNA 水解酶。每一种内切酶能识别 DNA 分子中由 4~ 6个核苷酸组成的特定序列?寄主控制的限制与修饰现象多种细菌能合成限制性内切酶,这是它们保护自己,降解外来 DNA 分子的重要手段。细菌细胞内的 DNA 由于相应序列上的 A或C碱基的甲基化而不被限制性内切酶攻击, 而外源 DNA 一旦进入细胞则立即被识别,双股 DNA 螺旋都被切断。?限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具,常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶?限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同,分为三类: Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型?限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同,分为三类: Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型有用十分有用无用在 DNA 克隆中的用途是是不是序列特异性切割距特异性位点位于特异性位点距特异性位点至少切割位点 EcoP1: 旋转对称 EcoB:TGANTGCT 寄主特异性位点序列 ATP 、 Mg2+ 、 Mg2+ ATP 、 Mg2+ 、辅助因子 2种不同的亚基单一的成分 3种不同的亚基蛋白质结构 2种不同的亚基单一的成分单一多功能的酶限制和修饰活性 III 型酶 II 型酶 I 型酶特性??ⅠⅠ型限制性内切酶型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序, 并在识别点附近的一些核苷酸上切割 DNA 分子中的双链,但是切割的核苷酸顺序没有专一性,是随机的。这类限制性内切酶在 DNA 重组技术或基因工程中用处不大,无法用于分析 DNA 结构或克隆基因。这类酶如 Eco B、Eco K等。?Ⅲ型限制性内切酶也有专一的识别顺序,但不是对称的回文顺序, 在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此,这种限制性内切酶切割后产生的一定长度 DNA 片段,具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。?Ⅱ型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序,并在该顺序内的固定位置上切割双链,是 DNA 重组技术中最常用的工具酶之一。识别的专一核苷酸顺序最是 4 个或 6 个核苷酸, 少数也有识别 5 个核苷酸以及 7 个、 8 个、 9 个、 10 个和 11个核苷酸的。Ⅱ型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序,即有一个中心对称轴,从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。??粘性末端粘性末端:是交错切割,结果形成两条单链末端,这种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,所以称为粘性末端。如 EcoRI 的识别顺序为: 5 ’…… G’ AA|TTC …… 3’ 3 ’…… C T T|AA ’G…...5 ’ | 表示中心对称轴,从两侧“读”核苷酸顺序都是 GAATTC 或 CTTAAG ,这就是回文顺序。‘表示在双链上交错切割的位置,切割后生成两个 DNA 片段,各有一个单链末端,两条单链是互补的,其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过 DNA 连接酶的作用而“粘合”??平头末端平头末端:Ⅱ型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链,产生平头末端。例如 Eco RV 的识别位置是: 5 ’…… GAT ’| ATC …… 3’ 3 ’…… CTA ’| TAG …… 5’切割后形成两种片段,片段末端同样可以通过 DNA 连接酶连接起来