文档介绍：安徽农业大学硕士学位论文纳豆固体发酵和纳豆激酶的催化特性姓名:路龙女申请学位级别:硕士专业:微生物学指导教师:唐欣昀 2011-06 I 中文摘要中文摘要中文摘要中文摘要纳豆是一种亚洲东方传统的发酵产品, 纳豆中的纳豆激酶是一种枯草杆菌蛋白激酶, 可口服吸收, 溶解血栓, 明显缩短纤维蛋白的溶解时间; 相比传统的尿激酶和链激酶等药物, 有快速溶解血栓、半衰期长、副作用小等优点。因此纳豆激酶是一种具有开发潜力的食源性溶栓药物,引起医药及食品研究领域的广泛关注。在纳豆固体发酵中, 接种量为 8% 时, 纳豆激酶的活性达到了 972IU/g 样品, 比传统 4 %接种量提高了约 64 %。固体发酵 24h ,纳豆激酶活性达到 709IU/g ,培养时间延长酶活反而下降。发酵结束后,纳豆表面覆盖厚厚的白色粘物,能拉出很长的细丝。当豆子被切成 2 瓣时菌株在纳豆表面的生长最旺盛。纳豆固体发酵最佳条件为:大豆破碎 2 瓣、接种量为 8% 、发酵时间 24h , 纳豆激酶活力最高为 976IU/g 。用纤维蛋白平板法,比较了液体发酵和固体发酵的酶活力,液体发酵中纳豆激酶的酶活为 142IU/mL ,固体的最佳酶活为 976IU/g 。在纳豆芽孢杆菌 BN-3 菌株液体发酵中, 发酵液的残糖量在最初 16h 以内是快速下降, 从 32mg/mL 降至 9mg/mL , 说明此时菌株消耗糖迅速生长, 在 16h 以后糖的消耗变化不大, 说明菌株生长稳定, 开始大量表达蛋白。纳豆激酶的酶活和蛋白质浓度变化基本一致, 都在 40 达到最高值, 时间延长酶活和蛋白质含量都将下降, 发酵时间在 40h 左右, 蛋白浓度达到的最大值 , 最高酶活力为。本实验数据显示在纳豆激酶液体发酵中纳豆杆菌活菌浓度、蛋白质浓度和纳豆激酶酶活之间存在很好的相关性,可以通过测定活细胞浓度来监控发酵进程。取 BN-3 菌株的发酵液离心,进行硫酸铵分级盐析沉淀, (NH 4 ) 2 SO 4 饱和度范围为 35% ~ 70% , 此时沉淀的蛋白质含量较高为。确定分级盐析饱和度之后透析、浓缩;经过 DEAE-Sepharose Fast Flow 阴离子层析,用 NaCl 进行阶段洗脱,具有纤溶酶活性的脱峰冷冻干燥后,调节蛋白浓度为后进行 SephadexG-100 层析, 获得了 SDS- 聚丙烯酰***凝胶电泳两条带的纤溶酶, 用纤维蛋白平板法测其酶活。结果:比活力为 24325 I U/mg ,活性得率为 47% ,纯化倍数。本实验利用脱脂牛乳为原料, 分析纳豆激酶在固体介质和液体介质中的催化乳蛋白水解特征,研究底物浓度、酶与底物浓度比(E/S) 和酶解时间对酶水解的影响。本研究旨在为纳豆激酶的活性测定和乳蛋白的酶解条件做初步探索。在固体平板上, 纳豆激酶水解乳蛋白的最佳酶解条件为酶解温度 37 ℃,底物浓度 2% 、酶与底物浓度比(E/S) 最适范围在 4~14 之间、酶解时间 16h , 此条件下平板上的水解效果最佳。在液体条件下,纳豆激酶水解乳蛋白最佳酶解条件为底物浓度 2% 、酶与底物浓度比(E/S) 为 6~10 、酶解时间 , 此条件下乳蛋白的水解度达 40%~70% 。本研究对纳豆激酶的活 II 性测定和乳蛋白的酶解条件进行初步探索。关键词:纳豆芽孢杆菌,固体发酵与液体发酵,纳豆激酶,分离与纯化,水解规律 III Abstract Abstract Abstract Abstract Natto is a kind of Asia Oriental traditional fermentation product, and nattokinase (NK) can dissolve blood clots. Being a kind of protein kinase of Bacillus subtilis , NK can be taken by oral and obviously reduce the time needed to dissolve globulin; Compared with the traditional medicines such as the urokinase and streptokinase, NK has the advantage of fast dissolving clots, long half-life, low side effect, etc. The enzyme strongly catalyzes fibrinolysis, suggesting that it is poss