文档介绍：华南师范大学实验报告学生姓名林鸿锦学号专业综合理科二班年级、班级07级课程名称生物化学实验实验项目氨基移换反应的定性鉴定实验类型□验证□设计□综合试验时间2008年11月23日实验指导老师陈文利实验评分目的学习一种鉴定氨基移换作用的简便方法及原理。原理氨基移换酶也称转氨酶,它能催化α-氨基酸的氨基与α-酮酸的α-酮基互换,这种作用称为氨基移换作用。转氨酶的种类甚多,任何一种氨基酸进行转氨作用时,都由其专一的转氨酶催化。。在各种转氨酶中,以谷氨酸—草酰乙酸转氨酶(简称谷草转氨酶、GOT)及谷氨酸—丙酮酸转氨酶(简称谷丙转氨酶、GPT)活力最强。其催化反应如下:上述两种酶均广泛存在于生物机体中,在正常人血清中也有少量存在。机体发生肝炎、心肌梗塞病变时,血清中转氮酶活力显著增加。本实验利用纸层析法,检查由谷氨酸和丙酮酸在谷丙转氨酶的作用下所生成的丙氨酸,证明组织内氨基移换作用。为了防止丙酮酸被组织中其它酶所氧化或还原,可加碘乙酸或溴乙酸抑制酵解作用或氧化作用。材料、试剂和器具材料家兔(饥饿16h)试剂1、1%谷氨酸溶液(用1%KOH溶液中和)2、1/15mol/L磷酸盐缓冲溶液()3、1%丙酮酸溶液(用1%KOH溶液中和)4、%碘乙酸溶液5、30%乙酸6、标准丙氨酸溶液(%)7、标准谷氨酸溶液(%)8、%水合茚三酮乙醇溶液9、酚溶剂(实验室已备)器具剪刀圆规、铅笔、直尺毛细管电吹风机恒温水浴滤纸培养皿试管及试管架实验过程制备肝匀浆实验室已准备好肝匀浆。酶促反应取2支干净试管,编号,按下表操作。试管编号1(待测)2(对照)1%谷氨酸溶液(滴)10101%丙酮酸溶液(滴)10101/15mol/L磷酸缓冲液(mL)%碘乙酸(滴)55新鲜肝匀浆(mL)2--煮沸过的肝匀浆上层液(mL)--2将两试管摇匀,置于37℃恒温水浴中保温40min。30%乙酸(滴)55两试管置于沸水中加热10min。现象及分析暗褐色沉淀(蛋白质变性)乳白色浑浊(蛋白质在前面煮沸时已沉淀)流水下冷却,过滤,取滤液备用。保温前(左均为待测管)保温后沸水浴后纸层析取15cm直径的圆形滤纸,在圆心处用圆规划一个3cm的同心圆。在同心圆的圆周上取4个点,每个点的距离相近,为点样的位置。用4支毛细管口分别取样品(1号点)和对照的滤液(2号点),以及标准谷氨酸(3号点)和丙氨酸(4号点),再轻轻触到4个点样的位置上,使每种溶液分别形成直径为2-3mm的圆斑,每次点样后,自然风干或吹风机吹干,再点下一次,重复3-4次。在15cm直径的圆形滤纸中心剪一个小圆孔。取一滤纸卷成圆筒,用剪刀将该圆筒状的滤纸的下端沿纵向剪为灯刷状,而滤纸的上端插入至15cm直径的圆形滤纸的小圆孔中(不突出纸面)。圆筒装的滤纸灯刷状的一端放在盛有层析剂的培养皿中,灯刷状的滤纸和层析剂相接触。培养皿上盖上大小一样的培养皿,纸上层析开始。待层析剂展开至15cm直径的圆形滤纸边缘1cm时,纸上层析结束。取出滤纸,晾干或吹干,以除去酚溶剂。%茚三酮乙醇溶液。用风筒吹热风使滤纸中温度加热至60-80℃,使氨基酸显色。计算及分析显色结果见下表:编号1234斑点与点样点距离(cm)(cm)