文档介绍：广西师范大学
硕士学位论文
沙田柚花柱自交不亲和相关基因的克隆与鉴定
姓名:阳晶
申请学位级别:硕士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:秦新民
20080501
沙田柚花柱自交不亲和相关基因的克隆与鉴定
年级:2005 级研究生:阳晶导师:秦新民教授
学科专业:生物化学与分子生物学研究方向:植物基因工程
摘要
本研究以高度自交不亲和的沙田柚(Citrus grandis var. Shatinyu Hort.)为试材,采用
抑制性消减杂交技术,分别以沙田柚自交花柱 cDNA 为检测子,异交花柱 cDNA 为驱动子,
构建了自交花柱正向消减 cDNA 文库,在沙田柚中克隆了与自交不亲和相关基因的 EST。
并运用菌液 PCR 技术、重组质粒提取和酶切相结合的方法对文库进行了筛选,从中随机挑
取了部分阳性克隆进行测序。所测序列用 NCBI-Blastx 和 Blastn 在线软件分析,通过与
Genbank 中的序列数据库进行同源性比较,我们找到了一些与沙田柚自交不亲和相关的基
因,为进一步阐明沙田柚自交不亲和的分子机理奠定了基础。
研究结果如下:
蓝白斑筛选实验表明,SSH 文库重组率高于 95%,共有 247 个独立克隆;PCR 检测和
重组质粒酶切结果表明,文库共获得 128 个阳性克隆,其插入片段的大小分布在 -
之间,主要集中在 250-500bp 之间;随机挑取的 120 个阳性克隆的测序结果显示,共获得
30 条独立的 ESTs,其中 23 条具有明确的功能比对结果,占总数的 %。
23 条 ESTs,通过 Blastx 搜索,找到两类与自交不亲和相关的基因:hect E3 泛素连接
酶和蛋白激酶表达基因,前者可能通过泛素/26S 蛋白酶体途径介导沙田柚自交不亲和反应,
后者可能通过蛋白质磷酸化与去磷酸化的细胞信号识别与转导途径介导沙田柚自交不亲
和反应;还找到柱头表达蛋白、质膜 H+ ATPase、rRNA 内含子编码核酸内切酶以及膜关联
蛋白表达基因,这些基因有可能为“膜受体”假说提供分子水平上的证据。
另 7 条 ESTs,通过 Blastn 搜索,发现其中两条与已报道的自交不亲和相关基因在核酸
水平上有较高的同源性,即编码 S1-RNase、S9-RNase 的基因,相似度分别达到了 88%和
89%,这 2 条 ESTs 极有可能是决定沙田柚自交不亲和的 S-基因。还有两条与泛素/26S 蛋
白酶体途经相关的基因和一些与自交不亲和信号转导相关的基因,以及与细胞凋亡、通道
运输和分子伴侣相关的基因,它们可能直接或间接参与沙田柚的自交不亲和反应。
为研究所获得的差异表达基因具有的生物学功能,我们把由 Blastx 搜索到的蛋白质信
息按 GO 分类系统聚成了 9 类,根据所占比例的大小顺序排列如下:催化活性、结合类功
能、生理学途径、细胞膜成分、分子伴侣、转录调控、调节酶活性、离子运输以及细胞凋
亡。这些信息表明沙田柚自交不亲和反应可能是一个复杂的多基因协同作用过程。
此外,还发现抗冻蛋白、柑橘腐根病病毒抗性、动力蛋白重链家族蛋白等与植物逆境
胁迫和抗病性功能相关或在核酸水平上有较高同源性的基因。
这些研究为下步克隆相关基因和阐明沙田柚自交不亲和机理的研究打下了良好基础。
关键词:沙田柚;自交不亲和;抑制性消减杂交;花柱;cDNA 文库
I
Cloning and Identification of Genes Related to
Self-patibility of Citrus grandis var. Shatinyu Hort. Styles
Grade: 2005 Master Candidate: Yang jing Supervior: Pro. Qin xin-min
Speciality: Biochemistry and Molecular biology Subject: Plant Gene Engineering
Abstract
Being one of the important fruit trees in south China, the shaddock (Citrus grandis var.
Shatinyu Hort.) tree is a typical gametophytic self-patibility (GSI) plant. Its lower yields
has greatly limited the development of the shaddock pro