文档介绍：低温乙醇法从人血清中提取免疫球蛋白实验目的利用低温乙醇法从人血清中分离出免疫球蛋白(Ig),并获得副产物血清白蛋白。实验原理(1)低温乙醇法Cohn6法:美国哈佛大学E·J·COHN教授研究组,在短短两年建立了低温乙醇分段提取法。方法原理:往蛋白水溶液中加入中溶性有机溶剂,如乙醇、***等,主要是降低水分子的活度,降低溶液的介电常数,从蛋白分子周围排斥水分子,使蛋白分子之间通过极性基团的相互作用,在德华力作用下,发生凝聚。不过由于有机溶剂存在,降低了蛋白分子表面憎水基团的作用,因而引起蛋白分子聚集的主要极性基团的相互电荷之间的引力。(文献20)分离过程中,二法通过五个因素的变动(五变系统),使很多血浆蛋白质得以分离。这五个因素及其各自的作用是;①乙醇:使蛋白质分子“脱水”;⑦pH值;蛋白质在等电点时易于沉淀;②电解质浓度:在低离子浓度下,对蛋白质溶解度有较大影响;④蛋白质浓度:浓度越低,其沉淀作用越小;⑥温度:在低温下,可避免乙醇对蛋白质的变性作用。同时,蛋白质溶解为吸热反应,溶解度随温度上升而增高。经实验得知,利用低温乙醇法能将血清蛋白分成六个组分(Ⅰ~Ⅵ),其中免疫球蛋白IgG主要存在于Ⅱ+Ⅲ中,白蛋白Alb主要存在于Ⅴ中。(2)Cohn氏9法;该法对Cohn氏6法的组分Ⅱ+Ⅲ作进一步分离和提纯,可获得组分Ⅱ—l,2,3(Y—G),组分Ⅲ一1(同种凝集素),组分Ⅲ—2(凝血酶原),组分Ⅲ—3(血浆酶原)等产品。其工艺流程见图:乙醇法生产中所用的乙醇是通过予冷、慢速搅拌滴入的。其体积可按下式计算:式中V=所需乙醇体积;V0=原来溶液体积;C1=原来溶液乙醇浓度;C2=所需达到乙醇浓度;C3=加入乙醇的浓度。::95%乙醇,,磷酸盐缓冲液Ⅰ,磷酸盐缓冲液Ⅱ,3mol/LNaCl溶液,1mol/LNaHCO3,生理***化钠溶液,麦芽糖,:方法与步骤基本思路:血清的初处理——利用Cohn6法得到组分Ⅱ+Ⅲ——利用Cohn9法得到IgG——IgG沉淀的保存(浓缩蛋白液或冻干品)——Ig物理性状及生化检定(蛋白含量、纯度、免疫活性、稳定性)(文献[4],)(1)将血清从冷冻箱(-5C至-20℃)取出后,先置于2-8℃冰箱使之溶解(2)在室温下使之全溶。以上操作注意随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生。(3)热灭活(目的是为了去除血清中补体等对热敏感的物质,通常因为高温处理影响了血清的质量,故省略)。(生物制品基础摘录4~5,文献4、17)(1)量取血清体积100mL,搅拌降温至0~4℃,,,加乙醇至8%,加入乙醇的时间控制在60~90min;从加乙醇开始起为反应体系降温,保持反应温度在-2~-4℃;加完乙醇后取样测pH值,;继续搅拌1h,静置30min;3000r/min离心10min,去除上清,收集沉淀并称取质量。(2)沉淀中加入0~4℃的注射用水,加水量为沉淀质量的7倍,持续搅拌直至成为均匀的蛋白浆;取样测pH值,蛋白浆中加磷酸盐缓冲液Ⅰ在-5℃,~,,加乙醇至25%