文档介绍：国家重点基础研究发展计划(973计划)课题5任务书调整方案项目名称:牛羊重要寄生虫致病机制的分子基础课题编号:2015CB150305课题名称:寄生虫免疫逃避重要分子的鉴定与功能一、调整依据和思路免疫逃避是寄生虫在宿主体内存活的关键,并与致病密切相关。线虫、吸虫等主要通过产生排泄分泌物(ESP)释放免疫抑制因子导致免疫抑制,原虫则形成带虫空泡,与宿主免疫系统隔离,或使宿主免疫细胞发生转化,功能降低。围绕项目总目标,本课题针对“家畜寄生虫免疫逃避”这一关键科学问题,旨在发现并鉴定捻转血矛线虫和片形吸虫主要免疫抑制分子并阐明其功能及与致病的关系;发现并鉴定新孢子虫带虫空泡形成关键蛋白分子并阐明其功能;分析泰勒虫感染对细胞免疫功能的影响,阐明虫体转化细胞后对细胞免疫功能的抑制作用。为了实现上述预期目标,本课题确定了研究内容,制定了研究计划和技术路线,安排了年度计划。两年来,本课题执行情况良好,基本完成了前两年计划的研究任务,基本实现了预期目标,获得了下述阶段性研究成果:(1)证明捻转血矛线虫ESP具有免疫抑制作用,发现146个HcESP蛋白与山羊PBMCs结合、21种与山羊细胞因子结合、捻转血矛线虫的L4、L5、早期成虫和晚期成虫4个阶段均与PBMCs结合的蛋白47种,并对其中的24个结合蛋白的免疫调节功能进行了研究,为捻转血矛线虫免疫逃避的分子机制研究提供了科学依据。(2)证明片形吸虫ESP中有32个蛋白与宿主PBMCs及细胞因子结合,为片形吸虫免疫逃避及免疫抑制机制的研究奠定了基础。(3)率先开展了将iTRAQ技术应用于新孢子虫感染宿主时,新孢子虫的免疫逃避和宿主细胞的天然免疫应答研究中,完成了差异蛋白的生物信息学分析,为后续发掘新孢子虫纳虫泡的形成关键蛋白奠定基础,建立了新孢子虫感染牛肾细胞(MDBK)的感染模型,为研究牛羊感染新孢子虫免疫逃避机制提供了技术支撑。(4)初步建立了泰勒虫转化的牛B细胞、巨噬细胞和DC细胞系,发现泰勒虫感染后,宿主细胞中41个免疫相关基因转录情况发生了改变。深入研究有望阐明泰勒虫对宿主免疫细胞的抑制作用和机理。上述研究及已取得的阶段性成果表明,本课题已确定的研究内容恰当,制定的研究方案和技术路线合理、可行。经过继续深入研究,有望在“寄生虫免疫逃避”研究方面获得大的突破,为项目总目标的实现做出贡献。本课题“新孢子虫”相关研究发现,参与新孢子虫纳虫泡组成的蛋白,通常具有跨膜结构,直接表达完整的ORF会出现表达量过低的现象,不利于后期的抗体制备,因此对于表达量过低的蛋白应采取分段表达或者截短表达的方式提高表达量,再通过感染血清验证各分段蛋白的反应原性,筛选出反应原性强,表达量高的蛋白进行后续研究。单克隆抗体虽然对比多克隆抗体特异性高,但是抗体制备的成本高,尤其是时间成本过高,在研究中发现不太适合制备对于iTRAQ筛选出的大量蛋白的抗体。本研究在前期准备中想利用多克隆抗体进行初步筛选,再通过单克隆抗体进行深入验证以降低时间成本。但试验结果表明,本研究所制备的多克隆抗体已经能够完成亚细胞定位的任务,所以建议改用多克隆抗体代替单克隆抗体进行细胞定位研究。免疫荧光技术因其较高的敏感性和直观的观察方法被广泛的应用于蛋白质亚细胞定位的研究中,本研究应用激光共聚焦免疫荧光试验代替免疫组化试验,提高了试验效率,节约了试验成本,增加了实验的可行