引物设计的原理和程序.pdf

文档介绍：引物设计的原理和程序
一、设计原理
1、择合适的靶序列:设计引物之前,必须分析待测靶序列的性质,选择高度保守、碱
基分布均匀的区域进行引物设计。
2、长度:一般来说,寡核苷酸引物长度为 15~30bp。
3、 Tm 值:引物的 Tm 值一般控制在 55~60℃,尽可能保证上下游引物的 Tm 值一致,
一般不超过 2℃。若引物中的 G+C 含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证
一定的退火温度。
4、(G+C)含量:有效引物中(G+C)的比例一般为 40~60%。
5、碱基的随机分布:引物中四种碱基的分布最好是随机的,不存在聚嘌呤和聚嘧啶,
尤其在引物的 3’端不应超过 3 个连续的 G 或 C。
6、引物自身:引物自身不存在连续 4 个碱基以上的互补序列,如回文结构,发夹结构
等,否则会影响到引物与模板之间的复性结合,尤其避免 3’末端的互补。
二、引物设计操作流程、
序列下载


同源性比较


引物设计筛选
1、序列查找
根据所需检测的病原体或者待检特定基因,
网址查询有关序列。








2、同源性比较主要有两种方法
A、 网址进行在线的两两比较。









热线电话:[phone] 8009881995 E-mail:******@.cn 网址:
B、采用 OMIGA, PCGENE 等软件进行两两或多序列比较。
1、打开 OMIGA 软件,导入(import)下载存盘的纯文本序列文件:

热线电话:[phone] 8009881995 E-mail:******@.cn 网址:
2、选择待比较的多条序列,右键点击“align sequences”命令;














3、等待计算机处理,直至状态显示排列结束,点击“alignment”显示结果;







4、“alignment”结果,相同碱基以同色标记

热线电话:[phone] 8009881995 E-mail:******@.cn 网址:
三、引物设计与筛选 Primer Premier 软件为例,进行引物设计和筛选的操作示范
1、打开软件,调入序列







2、选择路径,