文档介绍：中南民族大学
硕士学位论文
微生物谷铵酰胺转铵酶基因的克隆与表达
姓名:彭宝玉
申请学位级别:硕士
专业:@
指导教师:何冬兰
20100501
中南民族大学硕士学位论文
摘要
谷氨酰胺转胺酶, 又称转谷氨酰胺酶(Transglutaminase,简称 TGase 或 TG,全称:
protein-transglutayltransferase, ),其系统名称为蛋白质-谷氨酸-γ-谷氨酰胺基转移
酶。谷氨酰胺转胺酶以蛋白质或多肽中的赖氨酸残基的ε-氨基作为酰基受体,以肽链中的
谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基作为酰基供体,在蛋白质分子内或分子间形成ε-(γ-glutamyl)lys
共价键,使蛋白质分子发生交联聚合,从而改善蛋白质食品的特性,在食品工业中有非常
高的应用价值。
谷氨酰胺转胺酶广泛存在于从细菌到哺乳动物中的各种生物中。动物来源的谷氨酰胺
转胺酶需要 Ca2+来暴露其活性区的半胱氨酸残基的位点。对于微生物来源的谷氨酰胺转胺
酶研究较少,其主要来源于链轮丝菌属或枯草杆菌属,前者产生的是胞外酶,而后者的酶
主要在孢子上。
从产酶菌株链轮丝菌 H-197 中提取总 DNA ,设计特异性扩增引物进行 PCR,扩增出谷
氨酰胺转胺酶全长产酶基因,并进行测序验证。通过对基因序列的生物软件分析,谷氨酰
胺转胺酶基因有 1257 对碱基,GC 含量为 %。编码 418 个氨基酸,预计翻译的蛋白等
电点 pI 为 ,分子量为 kD。
设计加有 Bam HI,Hind Ⅲ及 Xho I 酶切位点及保护碱基接头的特异性引物,扩增目的
基因片段,进行 TA 克隆,再将其酶切下 MTG 片段后,将其亚克隆到到 pET-28a,pET30a,
pET22b,pGEX-4T-1 这四种表达载体上,研究其表达特性。将得到的亚克隆重组转化子,
转化到 E. coli DH5α中进行甘油保存,转化到 E. coli BL21(DE3)进行表达研究。需进一步
的测序验证目的基因与载体是否正确连接以及 MTG 基因是否发生突变。
获得了四种具有重组谷氨酰胺转胺酶(rMTG)基因重组大肠杆菌菌株,分别为
pET28a-MTG/BL21(DE3) 、 pET30a-MTG/BL21(DE3) 、 pET22b-MTG/BL21(DE3) 、
pGEX-4T-1-MTG/BL21(DE3)。
对 pET28a-MTG/BL21(DE3)、pET30a-MTG/BL21(DE3)这两种重组菌株进行 IPTG 诱
导小量表达,发现 pET28a-MTG/BL21(DE3)菌株在 37℃下以 1mM IPTG 诱导 4 小时表达量
最大;而 pET30a-MTG/BL21(DE3)菌株在 37℃下以 1mM IPTG 诱导 5 小时表达量最大。
pET28a-MTG/BL21(DE3)菌株的最佳 IPTG 浓度为。pET30a-MTG/BL21(DE3)菌株的
最佳 IPTG 浓度为。
对 pET22b-MTG/BL21(DE3) 、pGEX-4T-1-MTG/BL21(DE3) 这两种重组菌株进行
IPTG 诱导小量表达,发现 pET22b-MTG/BL21(DE3)菌株在 37℃下以终浓度 1mM IPTG 诱
导 2 小时下表达量最大,原因尚需摸索;而 pGEX-4T-1-MTG/BL21(DE3)菌株在 37℃下以
终浓度 1mM IPTG 诱导 4 小时表达量最大,表达的目的蛋白的大小符合预期估测值,
GST-MTG 融合蛋白分子量大小为。
根据正交试验确定 pET30a-MTG/BL21(DE3)重组菌株的最佳组合诱导条件为:摇菌转
- I -
微生物谷氨酰胺转胺酶基因的克隆与表达
速 250r/min、37℃下加入终浓度为 IPTG 诱导 4h。
pET30a -MTG/BL21(DE3)菌体经裂解超声后,用 SDS-PAGE 分析蛋白的表达情况,结
果表明重组蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中;上清含有部分可溶性的重组 MTG 蛋
白,酶活为。包涵体蛋白经透析复性法后电泳,发现在大小约 47KD 条带处是
一条浅浅的蛋白带,测酶活为 U/mL。使用稀释复性法后,未见目的条带,稀释复
性法未成功。Sephadex G-75 凝胶过滤层析复性,测峰值酶活平均为 ,是一种
很好的复性的方法,温和而省时。
通过降低温度诱导的策略,在 37℃培养、24℃诱导时,以 1mM 终