文档介绍：河北医科大学硕士学位论文基因工程重组西妥昔单抗质量控制研究姓名:王惠欣申请学位级别:硕士专业:药物分析学指导教师:张兰桐 20070301 中文摘要基因工程重组西妥昔单抗质量控制研究摘要目的:研究基I大1J:程重组西妥昔单抗(Cetuximab)质蜊。控制办法,为质虽。标准的制定提供科学依据。西妥旨单抗(Cetuximab)是一种重组人鼠嵌合型单克隆抗体,主要通过十扰癌细胞表面的表皮生长因子受体(EGFR)的蛋白质生长,通过抑制表皮生长因子受体,减少癌细胞进入正常组织的几率,控制癌细胞的转移,达到抗痈}j的,它是迄今第一个获得批准治疗结肠癌的单克隆抗体药物。由Imclone、(商品名为Erbitux),FDA2004年2月批准为晚期直、结肠痛二线用药。迄今为止,国内尚无西妥昔单抗的系统研究, 小谍题旨在研究基I大JJ二程重组西妥昔单抗(Cetuximab)质世控质方法。方法:本课题根据《中国生物制品规程》2000年版、《rl- 华人民共和国药典》2005年版3部以及《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》、《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》的规定和要求,结合单克隆抗体类药物的特点, j:要采用RP—HPLC和ELISA方法,对西妥昔单抗的理化忡质及质量控制力‘而着重从以F几个方面进行了研究,为新药质量标准的制定提供了依据。国内目前还没有周类单克降抗体药物,因此石j『究内容均未见报道。’ Cetuximab成。弛中由于制剂配方含有甘氨酸、甘露醇和 ul:in80保护剂,川经典Lowry法测定Cetuximab成品蛋白中文摘要浓螋时会产’l二较强的十扰。本文采用三***乙酸和脱氧腰酸钠先沉淀蛋白质,以排除制剂配方的干扰,建立了测定 ,并进行了方法学研究。,川胰蛋白酶断切Cetuximab,以Sephasll peptide C18(×250mm)为已谐十1;,%(v/v)TFA/%(v/v)TFA/乙8占为流动十廿,梯皮沈脱,,以考察J。 l协与标准品之问1司质性以及不同批次之间产品的同一性。建立了间接ELISA测定Cetuximab抗体含量的方法,利用Cetuximab可与表皮生长因子受体(EGFR)特异性结合, 采用EGFR包被酶标板作为固相抗原,加入待测Cetuximab Human IgGFC,用四***联苯***(TMB) 渺色,酶联仪测定450rim吸收值,以Erbitux为标准品,以标准品OD吸收值对Erbitux浓度的对数作标准曲线,以样 t怙OD吸收值在标准曲线上读出待测样品中Cemximab抗体含品,并进行_』,力法学研究,用于检测培养液中抗体的农丛水、I‘。建立了检测Cetuxlmab抗体亲和常数的非竞争ELISA法, 经确定最佳EGFR包被浓度范围、最佳Cetuximab抗体浓度, 得到不同浓度EGFR包板条件下与Cetuximab抗体结合反膨曲线,计算Cetuximab抗体的亲和常数。用于筛选有高亲和/J 抗体的阳性克隆株,并考察Cetuximab单克隆抗体的亲和常数,从而建立产册。Cemximab市H关的质量标准。埘Cetuximab抗体的杂质进行研究,采用***菅配毖标记DNA检测法测定Cetuximab样品的CHO宿:卜细胞的,贬中文摘要余DNA含量,采川ELISA法测定Cetuximab样品中的衍1. 蛋白残留量、牛m清白蛋白残留量。结果:TCA—Lowry沉淀法测定Cetuximab蛋白含量,之『禹性好,排除了Cetuximab成品中甘氨酸、甘露醇和吐溢80 保护剂对Lowry法J虹生的较强干扰;回收率高,5个不同浓嫂(30、60、90、120、150弘g/m1)下的平均回收率均在 %.%之间;重复性好,相对标准偏差小于5%。,- 的腆蛋白酶酶切胍网均与对照品一致,说明批间蛋白质结构见自。同+“洼,且证。火Cetuximab与对照品Erbitux一级结构相同,结果还表明,所选的酶切条件和色谱条件稳定,符合。戈验要求。建立测定Cetuximab抗体含量的间接ELISA方法,确定 EGFR的包被浓度为1pg/rnl,抗体标准工作曲线范围在 ,半对数曲线线性关系良好。该方法重复性较好,各浓度卜(20、10、5、2ng/m1)相对标准偏差小丁: 9%,%.%之间,专属性好,可以排除培养液中杂蛋白的干扰,特异性强,可以为重纰